MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
Mục đích:
Phát hiện RNA đặc trưng của virus Dengue trong huyết thanh hoặc huyết tương người.
Nguyên lý:
Xác định sự có mặt của gen đặc trưng sử dụng các cặp mồi và probe cho virus Dengue bằng kỹ thuật Real-time RT- PCR
CHUẨN BỊ
Người thực hiện:
Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành vi sinh (và / hoặc sinh học phân tử / sinh học/công nghệ sinh học).
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành vi sinh (và / hoặc sinh học phân tử/ sinh học / công nghệ sinh học).
Phương tiện, hóa chất:
Trang thiết bị:
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Tủ thao tác PCR.
Máy Real - time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Máy ly tâm > 12000 gpm / phút.
Máy ly tâm lạnh dùng cho tube 0,2 ml.
Máy ủ nhiệt .
Máy vortex.
Tủ lạnh 2oC - 8oC.
Tủ âm sâu (-20oC hoặc -70oC).
Micropipette 10 – 1000 μl.
Hóa chất, sinh phẩm và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm):
** Ghi chú:
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần / 1 năm).
Bệnh phẩm:
Huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm:
Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh.
Tiến hành kỹ thuật:
Tách chiết RNA tổng số .
Thực hiện Real-time RT-PCR.
Thực hiện bước này với các tube qPCR mix được giữ trong khay giữ lạnh hoặc trên đá vảy.
Chỉ lấy đủ số tube qPCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng qPCR phải spin down nhanh tube qPCR để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
Chuẩn bị các thành phần của phản ứng Real-time RT-PCR.
Thêm 5 µl của mẫu RNA, chứng dương hoặc chứng âm vào từng tube qPCR đã gồm đầy đủ các thành phần.
Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình realtime PCR.
Cài đặt vị trí mẫu trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy realtime PCR.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Đọc kết quả ở bước sóng 530 (kênh màu FAM).
NHỮNG LƯU Ý VÀ XỬ TRÍ
Đọc kỹ hướng dẫn qui trình xét nghiệm trước khi thực hiện.
Bảo quản bộ kit theo đúng hướng dẫn theo hướng dẫn của nhà sản xuất, riêng thành phần mẫu chứng dương nên giữ ở -80oC cho bảo quản lâu dài.
Khu vực tách RNA, mix phản ứng qPCR phải được bố trí biệt lập và khử trùng bề mặt bằng dung dịch sodium hypochloride 0,5%, dụng cụ sau sử dụng phải rửa kỹ dưới vòi nước với xà phòng, sau đó lau lại bằng dung dịch RNase AWAY™ Decontamination Reagent; chiếu tia tử ngoại khi trước và sau khi thao tác để tránh nhiễm chéo.
Quá trình mix thực hiện trên đá vẩy hoặc PCR cooler, thực hiện chạy Realtime-PCR ngay sau khi mix xong phản ứng.
Trong trường hợp mẫu chứng dương và mẫu chứng âm xuất hiện không đúng với diễn giải ở phần IV thì phải kiểm tra lại Master mix, chứng dương và quá trình tách RNA tổng số, thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
