EBV Real-time PCR

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích

Phát hiện gen đặc trưng của Epstein-Barr virus (EBV) trong máu, dịch não tủy và các loại dịch khác.

Nguyên lý

Phát hiện gen đặc trưng của EBV dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real time PCR.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện.

Tủ an toàn sinh học cấp 2.

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.

Máy ly tâm 25000 x g.

Máy ủ nhiệt.

Máy vortex.

Tủ lạnh 2ºC - 8ºC.

Tủ âm sâu (- 20ºC hoặc -70ºC).

Micropipette các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao

Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần.

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Mảnh sinh thiết hoặc máu toàn phần chống đông EDTA, dịch não tủy, các loại dịch khác....

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 3.

Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.

Tiến hành kỹ thuật:

Bộ sinh phẩm EBV Real-time PCR (VD).

Tách chiết DNA

Thực hiện phản ứng real-time PCR

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cầnTrước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube EBV rPCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.

Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình realtime PCR.

Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

Chọn màu “FAM” và “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.

Lưu file dữ liệu vào máy tính.

Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Điều kiện của phản ứng

Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính).

Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính.

PHÂN TÍCH MẪU

Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước, kết luận “Mẫu dương tính”.

Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu từ sau chu kỳ 36, kết luận “Mẫu nghi ngờ” và đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét nghiệm sau 1-3 tháng.

Mẫu có đường biểu diễn âm tính, kết luận “Không tìm thấy virus trong mẫu”. Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.

In đồ thị kết quả

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

NGUYÊN NHÂN

Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.

KHẮC PHỤC

Pha loãng mẫu từ 10 - 100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.

Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

facebook.com/BVNTP