NTM (Non Tuberculosis Mycobacteria) nuôi cấy môi trường lỏng

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích:

Phát hiện các Mycobacteria không phải là Mycobacterium tuberculosis bằng kỹ thuật nuôi cấy môi trường lỏng.

Nguyên lý:

Tube MGIT chứa môi trường lỏng Middlebrook 7H9 có oxy hòa tan và 1 hợp chất gồm: chất màu huỳnh quang, tris 4, 7-diphenyl-1, 10-phenonthroline ruthenium chloride pentahydrate được gắn vào lớp silicone ở đáy tube. Khi vi khuẩn phát triển oxy bị tiêu thụ, nồng độ oxy giảm, chất màu huỳnh quang thoát ức chế sẽ phát quang trong tube MGIT, có thể quan sát bằng tia UV. Cường độ phát quang tương ứng với mức độ tiêu thụ oxy, tương ứng nồng độ vi khuẩn phát triển trong tube môi trường. Máy tự động giám sát sự phát quang 60 phút một lần. Vi khuẩn mọc càng nhiều càng tăng độ phát quang. Vi khuẩn mọc sẽ được định danh để xác định các Mycobacteria khác không phải là Mycobacterium tuberculosis.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện:

Người thực hiện cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành vi sinh.

Phương tiện, hóa chất:

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị:

Tủ an toàn sinh học cấp 2.

Máy li tâm đủ tiêu chuẩn an toàn sinh học, đủ lực li tâm (>= 3000g).

Máy lắc.

Tủ lạnh.

Cân.

Đồng hồ phút.

Kính hiển vi.

Nồi hấp.

Hệ thống máy BACTEC- MGIT 960 hoặc 320.

Pipet tự động loại 100-1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Ghi chú:

Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm:

Đờm, dịch phế quản, phân, mủ, dịch não tủy, các loại dịch khác,…

Phiếu xét nghiệm:

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm:

Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh (xem Phụ lục 1 và Phụ lục 4).

Tiến hành kỹ thuật:

Chuẩn bị môi trường hóa chất.

Xử lý bệnh phẩm, nhuộm soi, nuôi cấy.

Định danh: Soi định danh và định danh nhanh sắc ký miễn dịch.

Xử lý vật liệu lây nhiễm.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Kết quả nhuộm soi:

Số lượng AFB	Kết quả	Phân loại
Có > 10 AFB/1 vi trường (Soi ít nhất 20 vi trường)	Dương tính	AFB 3 (+)
Có từ 1 - 10 AFB/1 vi trường (Soi ít nhất 50 vi trường)	Dương tính	AFB 2 (+)
Có từ 10 - 99 AFB/100 vi trường	Dương tính	AFB 1 (+)
Có từ 1 - 9 AFB/100 vi trường	Dương tính	Ghi số lượng AFB/100 vi trường
Không AFB/100 vi trường	Âm tính

Kết quả cấy:

Máy báo tự động mỗi giờ, kết quả dương tính trung bình trong vòng 3 ngày đến 2 tuần.

Kết quả cấy âm tính máy báo sau 6 tuần.

Ngoài ra tuýp cấy máy báo âm tính có đầu vào nhuộm soi dương phải ly tâm lấy cặn nhuộm soi, các tuýp máy báo âm phải quan sát bằng mắt thường phát hiện cặn vụn trước khi hủy.

Kết quả định danh:

Soi định danh (phân biệt NTM với MTB).

NTM (Mycobacteria không phải lao) soi định danh không thấy cuộn thừng, AFB vụn thành đám.

Định danh nhanh bằng sắc ký (SD, TBcID…) (phân biệt NTM với MTB).

NTM (Mycobacteria không phải lao) âm tính (có 1 vạch màu tại vị trí “C”).

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Nhiễm chéo trong quá trình thao tác kỹ thuật: Hạn chế nhiễm chéo bằng cách phân loại nguồn bệnh phẩm dịch, đờm, nghi MDR, người bệnh thường... để Xử lý thích hợp. Không cấy chuyển chủng không làm tiêu bản soi định danh cùng lúc Xử lý bệnh phẩm. Chia nhỏ hóa chất dung dịch đệm, thao tác nhẹ nhàng tránh tạo hạt mù, chắt dung dịch vào thành tuýp. Không mở đồng thời các tuýp mẫu Mỗi mẻ Xử lý 6 - 8 mẫu.

Tỷ lệ ngoại nhiễm cao: Giảm ngoại nhiễm bằng cách Xử lý mẫu càng sớm càng tốt. Mẫu bảo quản 2 - 8ºC không quá 72 giờ, dịch dạ dày, nước tiểu Xử lý sớm trước 4 giờ kể từ khi lấy mẫu. Tuân thủ quy trình xử lý, nồng độ và thời gian tiếp xúc với hóa chất. Đảm bảo chất lượng môi trường, sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ trong hạn và vô trùng.

Nhầm lẫn hành chính: Kiểm tra cẩn thận về hành chính từ khâu nhận bệnh phẩm, vào sổ, trả kết quả, tránh nhầm lẫn. Khi thao tác kỹ thuật xếp mẫu theo thứ tự, tuân thủ qui tắc để cách ô trống đầu tiên.

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

facebook.com/BVNTP