Ureaplasma urealyticum Real-time PCR

✴️ Ureaplasma urealyticum Real-time PCR

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích

Xác định sự có mặt DNA của Ureaplasma urealyticum trong bệnh phẩm của người.

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Máy ủ nhiệt

Máy ly tâm > 12000 gpm/phút

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

Máy vortex

Máy Real-time PCR

Ống Eppendorf 1,5 ml ho c 2 ml

Các loại Micropipette điều chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl

Đầu côn có màng lọc 10 μl, 100 μl, 200 μl và 1000 μl

Tủ lạnh thường

Tủ âm sâu (20⁰C) ho c (-70⁰C) (nếu có)

Bộ lưu điện

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Ghi chú:

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo

Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Mủ hoặc dịch niệu đạo, âm đạo, dịch ngoáy họng.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

Tiến hành kỹ thuật:

VD sinh phẩm hóa chất vật tư tiêu hao Ureaplasma urealyticum rPCR kít hoặc tương đương

Tách chiết DNA

Cho một lượng mẫu DNA tách chiết được vào các ống phản ứng PCR có chứa các thành phần cần thiết của kit

Chạy phản ứng PCR theo chu trình nhiệt thích hợp trên máy Real-time PCR

Đọc kết quả

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm.

Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.

Bước 2: Kiểm tra độ nhạy

Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX - Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR không bị ức chế.

Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại ho c tín hiệu thấp với kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: Xác định mẫu dương tính

Mẫu có tín hiệu huỳnh quang với kênh màu FAM và có Ct: là những mẫu dương tính

Các mẫu có Ct <12 và tín hiệu huỳnh quang không tăng theo chu kỳ nhiệt:

pha loãng DNA mẫu với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix

Bước 4: Xác định mẫu âm tính

Mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu HEX, thì kết quả là mẫu bệnh phẩm âm tính

Nếu mẫu có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM nhưng không có Ct và dương tính với màu HEX, thì kết quả dưới ngưỡng phát hiện

Nếu mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu HEX , mẫu bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường

Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế

Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

facebook.com/BVNTP