Định lượng kháng thể kháng Tg (Anti Tg) bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ

NGUYÊN LÝ

Hiện tượng tự miễn tuyến giáp thường gặp ở phụ nữ. Nồng độ kháng thể (KT) ở phụ nữ tăng theo tuổi, tăng từ khoảng 10% ở tuổi 18-24 đến 30% ở tuổi 55-65 đối với TgAb. Phương pháp dựa trên nguyên lý định lượng miễn dịch phóng xạ cạnh tranh (RIA). Trong quá trình ủ KT kháng Tg đơn dòng pha rắn cạnh tranh với tự KT kháng Tg của mẫu cần đo ở những vị trí đặc hiệu có gắn ¹²⁵I (tracer). Sau khi hút khô và rửa, hoạt độ phóng xạ ở ống nghiệm được đo bằng máy đo gamma. Mức độ gắn sẽ tỷ lệ nghịch với nồng độ tự KT kháng Tg của mẫu.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Bác sỹ chuyên ngành Y học hạt nhân

Kỹ thuật viên xét nghiệm RIA

Kỹ sư, kỹ thuật viên vận hành thiết bị đo mẫu

Cán bộ hóa dược phóng xạ

Phương tiện, hoá chất

Phương tiện

2 máy đo Gamma Counter đo ¹²⁵I và xử trí mẫu tự động theo chương trình.

2 máy lắc ngang ( 200-350 vòng/phút,thường dùng 300 vòng/phút),

2 máy trộn.

Một giá cắm bộ micropipet có số hút 20 μl , 200 μl , 1000 μl và các hộp đựng đầu plastic các loại.

Giá cắm ống nghiệm .

Hoá chất:

RIA kít định lượng AnTg nhập của hãng. Thành phần kit gồm :

Hoá chất đủ cung cấp cho 100 lần định lượng. Bảo quản kit và hoá chất ở 2-8 0C.

Thời gian sử dụng của mỗi hoá chất ghi trên nhãn.

Chất đánh dấu phóng xạ (tracer): 1 lọ chứa chứa 22 ml Tg gắn iod, màu đỏ. HTPX 137 kBq mỗi ống. Chất bảo quản NaN₃ (<0,1%).

Chuẩn 0 (Calibrator 0): 1 lọ chứa 4,2 ml, chất bảo quản NaN₃ (<0,1%), pha sẵn

Chuẩn 1-5 (Calibrator 1-5): 5 lọ chứa 0,7 ml anti-Tg (huyết thanh người). Để có giá trị chính xác, đối chiếu với giá trị viết trên tờ dữ liệu kiểm tra chất lượng.

Chất bảo quản NaN₃ (<0,1%).

HTKT (Controls): 2 ống chứa 0,7ml anti-Tg (ht người). Để có giá trị chính xác, hãy tham khảo giá trị viết trên tờ dữ liệu kiểm tra chất lượng. Chất bảo quản NaN₃ (<0,1%).

Các ống nghiệm tráng KT: 100 ống nghiệm tráng KT đơn dòng của chuột kháng Tg. Những ống không sử dụng phải bảo quản ở 2-8⁰C, tránh ẩm.

Dung dịch rửa (cô đặc 50 lần): 1 lọ 20ml đệm tris-HCl cùng với thuốc tẩy và chất bảo quản NaN₃ (<0,1%). Pha thành 1.000ml với nước cất. Dung dịch rửa pha loãng để được 2 tháng ở 2-8 ⁰C.

Để đạt được kết quả tốt, những điều sau đây phải được tôn trọng:

Không trộn hoá chất ở các lô khác nhau.

Không sử dụng hoá chất quá thời hạn sử dụng.

Hãy sử dụng các đồ thuỷ tinh được lau sạch sẽ.

Hãy sử dụng nước cất được bảo quản trong các container sạch.

Tránh mọi sự ô nhiễm các mẫu; sử dụng đầu hút nhựa mới dùng một lần cho các mẫu và hoá chất.

Tất cả hoá chất phải đưa về nhiệt độ phòng (18-25⁰C) ít nhất 30 phút trước khi sử dụng.

CHỈ ĐỊNH

Tất cả các người bệnh có bênh liên quan đến tuyến giáp.Đặc biệt trong chẩn đoán,theo dõi tiến triển của bệnh sau điều trị ung thư tuyến giáp trạng thể biệt hoá bằng ¹³¹I.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH:

Không có .

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm

Người bệnh cần nhịn ăn sáng,được lấy 1-2 ml máu tĩnh mạch không chống đông.

Tiến hành kỹ thuật

Chuẩn bị huyết thanh người bệnh:

Người bệnh cần nhịn ăn sáng,được lấy 1 ml máu tĩnh mạch không chống đông. Sau khi lấy mẫu máu, huyết thanh được tách bằng phương pháp thông thường. Tiến hành định lượng ngay hoặc bảo quản đến 24h ở 2-8^oC. Thời gian bảo quản lâu hơn nên để ở -20^oC, thích hợp hơn là chia đều,tránh làm đông lặp đi lặp lại và tránh làm tan đông. Sau khi làm tan đông, mẫu huyêt thanh phải được trộn cẩn thận.

Cảnh báo và đề phòng: Các vật liệu thô có nguồn gốc từ người chứa trong hoá chất của kit này đã được kiểm định với các kit được cấp phép và đã xác định âm tính với KT kháng HIV1, HIV2, HCV và kháng nguyên HbsAg. Tuy nhiên cũng không thể đảm bảo hoàn toàn là những sản phẩm như vậy sẽ không truyền viêm gan, virus HIV hoặc bất kỳ virusẵnào khác, tất cả các vật liệu thô có nguồn gốc người có trong mẫu được định lượng phải được xử trí như tác nhân có tiềm năng nhiễm trùng. Bởi vậy, các chất thải của thử nghiệm phải được khử ô nhiễm và loại bỏ theo như các qui định đã ban hành. Các vật liệu dễ cháy dùng một lần phải được đốt thành tro; các vật liệu không dễ cháy dùng một lần phải được khử trùng trong nồi hấp ít nhất 1 h ở 121⁰C. Chất thải lỏng phải được trộn với sodium hypochlorite ở nồng độ cuối cùng là 3%. Để hypochlorite tác dụng trong ít nhất là 30 phút. Chất thải lỏng chứa acid phải được trung hoà bằng lượng base thích hợp trước khi xử trí với sodium hypochlorit.

Tránh làm đổ tung toé và tạo thành các hạt sương; trong trường hợp bị đổ, hãy rửa sạch bằng dung dịch sodium hypochlorit 3% và loại bỏ dung dịch này như là một chất thải có khả năng nhiễm trùng.

Một số hoá chất chứa sodium azid là chất bảo quản; để tránh tạo thành các azide kim loại gây nổ ở những que thăm bằng chì, đồng, các hoá chất nên được loại bỏ bằng xả nhiều nước.

Quy trình định lượng:

Đưa tất cả các hoá chất và mẫu về nhiệt độ phòng 30 phút trước khi sử dụng.

Trước khi dùng trộn mẫu nhẹ nhàng.

Đối với tất cả các máy chuẩn liều nên đo mẫu kép.

Dùng ống nghiệm thường để đo tổng xung và ống nghiệm có tráng KT để đo mẫu và HTKT.

Nhỏ 20 μl chuẩn, HTKT, mẫu vào các ống nghiệm tương ứng.

Thêm 200 μl tracer vào tất cả các ống nghiệm.

Trộn các ống nghiệm trên máy trộn và ủ 90 phút ở nhiệt đọ phòng trên máy lắc với 150 v/p.

Đổ, úp khô các ống nghiệm, trừ ống đo tổng xung.

Thêm 2 ml dung dịch rửa pha loãng vào mỗi ống nghiệm trừ ống đo tổng. Hút khô hoặc đổ, úp khô trên giấy thấm.

Đo hoạt độ phóng xạ phần liên kết trong 1 phút bằng máy đo gamma. Nên kiểm tra phông của thiết bị trước khi định lượng. Để tránh biến đổi độ nhậy hệ thống, phông phải được giảm đến mức tối thiểu hoặc điều chỉnh cho phù hợp.

LƯU Ý : nếu giá trị anti-Tg cao (>2.000UI/ml) với các mẫu của người bệnh thì mẫu gốc nên được pha loãng. Dùng chuẩn 0 để pha loãng, không được dùng dung dịch đệm.

Trộn và ủ: 90 phút nhiệt đọ phòng, trên máy lắc (150 v/p).

Hút và rửa: 1 x 2ml.

Đo.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

B₀cpm

Hiệu suất gắn = ----------- %.

Tcpm

Hiệu suất gắn với chuẩn, HTKT và mẫu = gắn % = B/B₀= chuẩn hoặc mẫu (cpm)/B₀ (cpm)*100.

Vẽ đường cong chuẩn theo thang chia log bằng cách đánh dấu % B/B₀ thu được với mỗi chuẩn (trục y) dựa vào nồng độ tương ứng (trục x). Tính toán % B/B₀ của mỗi mẫu và đọc nồng độ anti-Tg bằng IU/ml bằng phép nội suy trên đường cong chuẩn (định lượng).

VÍ DỤ VỀ TÍNH TOÁN

Các giá trị dưới đây chỉ được xem như là ví dụ, không được dùng trong dữ liệu thực nghiệm.