✴️ Kỹ thuật lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH)

NGUYÊN TẮC

Xét nghiệm lai tại chỗ gắn huỳnh quang (FISH) sử dụng mồi dò DNA gắn huỳnh quang để xác định khuyếch đại gen Her-2/neu.

 

CHUẨN BỊ

Người thực hiện:

Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01.

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01.

Cử nhân sinh học (không bắt buộc): 01.

Phương tiện, hóa chất:

Phương tiện:

Máy ThermoBrite.

Kính hiển vi huỳnh quang.

Phiến kính, lá kính.

Máy cắt lát mỏng.

Lưỡi dao cắt lát mỏng.

Tủ ấm 37o và 56o.

Tủ lạnh.

Ống hút.

Hóa chất.

Bộ kít PathVysion.

Cồn (70o, 80o, 85o, 90o, 100o).

Xylen.

Dung dịch rửa.

 

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Chuẩn bị mẫu:

Mẫu mô được cắt mỏng 4 micromet, gắn lên phiến kính đã được tráng silan.

Các mảnh cắt được ủ qua đêm ở nhiệt độ 56oC.

Đánh dấu vùng tế bào u xâm lấn bằng bút viết kính.

Khử parafin của mảnh cắt. 

Nhúng các mảnh cắt vào xylen 3 lần, mỗi lần 5 phút.

Khử nước bằng cồn 90o, 2 lần, mỗi lần 5 phút.

Làm khô các mảnh cắt ở 45oC: 2 - 5 phút.

Rửa nước cất 1 lần: 3 phút.

Rửa các mảnh cắt bằng dung dịch đệm 1 lần: 3 phút.

Nhúng trong dung dịch đệm nhiệt độ 80oC: 30 phút.

Rửa nước cất 1 lần: 1 phút.

Rửa bằng dung dịch đệm ở nhiệt độ phòng 2 lần, mỗi lần 5 phút.

Xử lý protease:

Các mảnh cắt được lau khô các vùng nước đọng.

Ngâm trong dung dịch protease: 10 - 60 phút ở nhiệt độ 37oC. 

Rửa bằng dung dịch đệm 2 lần, mỗi lần 5 phút.

Làm khô ở 45oC: 2 - 5 phút.

Khử nước:

 

Cồn 70o

1 phút, nhiệt độ phòng

Cồn 85o

1 phút, nhiệt độ phòng

Cồn 100o

1 phút, nhiệt độ phòng

Làm khô ở 45oC: 2 - 5 phút.

Tách DNA và lai đồng thời.

Dùng máy ThermoBite, thực hiện công đoạn trong buồng tối.

Làm ấm lọ chứa đoạn đầu dò bằng máy lắc.

Lấy 5 µl đoạn dò, nhỏ lên vùng ung thư xâm nhập đã được đánh dấu.

Gắn lá kính kích thước 22 mm x 22 mm, phủ mép lá kính bằng nhựa cao su.

Kích hoạt chương trình của máy.

Tách DNA ở 75oC: 5 phút.

Lai đoạn dò DNA đích ở 37oC: 18 giờ, đảm bảo buồng lai tối.

Tạo môi trường ấm, đậy nắp.

Rửa sau khi lai (thực hiện trong buồng tối).

Làm nóng dung dịch rửa sau lai ở 72oC.

Chuẩn bị một lọ dung dịch rửa sau lai ở nhiệt độ phòng.

Nhúng các mảnh cắt vào lọ dung dịch sau lai ở nhiệt độ phòng, lắc nhẹ để lá kính rời ra.

Lau những giọt nước đọng trên các phiến kính.

Nhúng vào dung dịch sau lai ở nhiệt độ 72oC: 2 phút.

Lau khô trong buồng tối.

Nhuộm màu tương phản nhân:

Nhỏ 5 µl DAPI vào vùng đã chọn.

Dán lá kính.

Khảo sát tiêu bản:

Bảo quản tiêu bản vào hộp giấy bạc, giữ ở - 20oC, ít nhất 30 phút trước khi quan sát.

Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi huỳnh quang có nhiều kính lọc các bước huỳnh quang.

 

KẾT QUẢ

Đánh giá kết quả dựa vào tỷ lệ tín hiệu màu vàng (gen Her-2 / neu) và tín hiệu màu xanh (nhiễm sắc thể 17). 

Đếm tín hiệu trên 20 nhân tế bào u xâm nhập, các nhân tế bào được đếm phải tách rời, không chồng lên nhau.

Tỷ lệ Her-2/NST17 < 1,8: Không khuyếch đại.

Tỷ lệ Her-2/NST17 ≥ 2,2: Có khuyếch đại.

Tỷ lệ 2,5 < Tỷ lệ Her-2/NST17 ≤ 5: Khuyếch đại thấp.

Tỷ lệ Her-2/NST17 > 5: Khuyếch đại cao.

1,8 ≤ Tỷ lệ Her-2/NST17 < 2,2: Khuyếch đại giáp biên cần đếm lại hoặc đếm thêm trên 20 nhân tế bào u xâm nhập nữa.

Số lượng tín hiệu màu xanh lá cây sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội và đa bội.

 

NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

KHÔNG CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN HIỆU YẾU

NGUYÊN NHÂN

CÁCH KHẮC PHỤC

Khử parafin không hết

Tăng thời gian khử parafin hoặc thay thế xylene mới

 

Sử dụng thiết bị lọc không đúng

Sử dụng thiết bị lọc theo đúng bước sóng của probe

 

Kính hiển vi lỗi

Gọi hỗ trợ kỹ thuật

 

Điều kiện lai không chính xác

Kiểm tra lại nhiệt độ máy lai hoặc buồng lai

 

Nhiệt độ rửa sau khi lai không chính xác

Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa hoặc tăng thời gian lai

 

Có bóng khí khi gắn lá kính

Loại bỏ bóng khí trước khi đưa vào máy lai

 

Không đủ dung dịch lai hoặc probe

Tăng thêm lượng probe 

 

Digest không đủ

Kiểm tra lại nhiệt độ digest hoặc tăng thêm thời gian digest

 

Thời gian cố định quá dài

Kiểm tra lại quy trình cố định bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định ngay sau mổ trong 6 - 48 giờ, hoặc có thể giảm bớt thời gian bộc lộ

 

TÍN HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM

NGUYÊN NHÂN

CÁCH KHẮC PHỤC

 

Tồn tại nhiều vùng khác nhau trên bệnh phẩm

Kiểm tra lại quá trình nhuộm DAPI

Tăng thêm thời gian cố định

 

Probe phân bố không đều trên bệnh phẩm do có bọt khí

-Thực hiện lại quá trình lai và đảm bảo không có bọt khí

 

Kích thước bệnh phẩm quá lớn

-Tăng thể tích dung dịch lai

 

NHUỘM NỀN CAO (HIGH GROUND)

NGUYÊN NHÂN

CÁCH KHẮC PHỤC

 

Do quá trình rửa sau khi lai 

Kiểm tra lại pH của dung dich rửa (7.2-7.5)

Kiểm tra lại nhiêt độ buồng rửa

Lắc trong quá trình rửa

Tăng thời gian rửa lên 5 phút

 

MẤT HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM

NGUYÊN NHÂN

CÁCH KHẮC PHỤC

 

Sấy tiêu bản không đúng

-Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy (56oC)

 

Bộc lộ quá mức

Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ

Giảm thời gian bộc lộ

Giảm thời gian digest

 

Biến tính quá mức

Kiểm tra lại nhiệt độ biến tính

Giảm thời gian biến tính

 

Bệnh phẩm bị bong ra khi loại bỏ lá kính sau khi lai

-Loại lá kính bằng cách ngâm tiêu bản sau lai vào dung dịch rửa và lắc đều

 

 

 

 

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

  facebook.com/BVNTP

  youtube.com/bvntp

return to top