Mycobacterium tuberculosis RFLP typing

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích

Phân nhóm di truyền các chủng M. tuberculosis.

Nguyên lý

Kỹ thuật phân nhóm vi khuẩn M. tuberulosis - Restriction fragement length polymophism (RFLP) dựa trên phương pháp lai phân tử với mẫu dò đặc hiệu với DNA của vi khuẩn lao được cố định trên màng lai. Tính đa hình về kích thước tạo ra do sự khác biệt về số lượng bản sao và vị trí của các đoạn IS6110 trên nhiễm sắc thể vi khuẩn cho phép phân loại M.tuberculosis thành các nhóm nhỏ.

Trên nhiễm sắc thể Mycobacterium tuberculosis có các đoạn IS6110. Trên đoạn IS6110 có các vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn, đồng thời ngoài đoạn IS6110 cũng có các vị trí cắt giới hạn tương ứng. Sử dụng enzyme cắt giới hạn chia bộ gene vi khuẩn thành nhiều đoạn có kích thước khác nhau. Số lượng bản sao IS6110 khác nhau cho ta số đoạn cắt khác nhau. Điện di, chuyển DNA lên màng lai, lai với mẫu dò đặc hiệu để phát hiện số lượng và kích thước các đoạn cắt.

CHUẨN BỊ

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Người thực hiện

Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Trang thiết bị

Tủ ATSH cấp II.	Cân điện tử.
Máy siêu ly tâm tuýp 1.5ml.	Pipette tự động 10, 200, 1000µl.
Máy ly tâm mini (Spin down).	Panh, kẹp (Forceps).
Máy ủ nhiệt khô/ướt.	Tủ sấy.
Máy siêu âm (Ultrasonic).	Nồi hấp khử trùng.
Máy nhân gene.	Tủ thao tác PCR.
Lò vi sóng (Microwave Oven).	Đồng hồ hẹn giờ.
Bộ điện di.	Hộp giữ lạnh.
Máy vortex.	Lò lai DNA.
Máy lắc ngang.	Hộp ủ phim X-ray.
Tủ lạnh 4^o/ - 20^o/ - 80^o.	Hộp rửa phim.
Hệ thống chụp ảnh điện di Pringraph.	Hệ thống UV Stralinker.
Hệ thống Vacuum Blotter.	Hệ thống Gel Documentation.
Máy đo nồng độ DNA Smart Spee^TMPlus.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Bệnh phẩm

Thực hiện xét nghiệm phân nhóm M. tuberculosis cho các bệnh phẩm là chủng vi khuẩn lao mọc trên môi trường đặc.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 2).

Tiến hành kỹ thuật

Lập danh sách, cập nhập thông tin mẫu cần xét nghiệm.

Xử lý mẫu theo danh sách đã trích lọc.

Tách chiết DNA vi khuẩn theo quy trình chuẩn.

Chuẩn bị thang DNA và mẫu dò IS6110.

Thực hiện phản ứng cắt bằng Enzyme cắt giới hạn.

Ước lượng/đo nồng độ DNA sau phản ứng cắt.

Điện di DNA.

Xử lý gel sau khi điện di.

Chuyển DNA lên màng lai.

Lai với ECL kít.

Rửa màng sau khi lai.

Phát hiện tín hiệu lai bằng ECL.

Đọc và phân tích kết quả.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Tín hiệu lai được thể hiện bằng những vach màu đen trên phim. Scan các phim này vào máy tính và phân tích bằng chương trình Bionumerics. Sau khi chuẩn hóa các phim, dựa trên hình ảnh các băng vạch, các mẫu chủng sẽ được so sánh với nhau và so với mẫu chuẩn để phân nhóm chủng M. tuberculosis.

Trong một số trường hợp khó nhận biết các băng vạch với nhau nên đôi khi kết quả không đồng nhất, cần lặp lại xét nghiệm để xác định kết quả

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Lỗi	Giải thích và cách Xử lý
Không có tín hiệu lai được phát hiện	Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ. Enzym đã bất hoạt. Chia nhỏ lượng enzym, bảo quản theo đúng điều kiện cần thiết và sử dụng hộp giữ lạnh khi pha mix. Điện di 5 µl sản phẩm PCR trên thạch Agarose 2% để kiểm tra quá trình nhân gene có thang DNA hay không. Enzym cắt mất hoạt tính. Hóa chất ủ phim ECL hết hạn. Kiểm tra quá trình thấm DNA lên màng.
Ảnh điện di không đặc hiệu, các đoạn cắt không rõ ràng	Quá trình tách DNA chưa tốt. DNA không tinh sạch, lẫn nhiều protein. Enzyme cắt giới hạn (RE) cần được bảo quản tốt trong dung dịch đệm có 50% glycerol ở -20°C. Khi thực hiện phản ứng cắt bằng RE, cần sử dụng nồng độ NaCl của dung dịch đệm từ thấp đến cao. Tối ưu hiệu quả hoạt động của Enzyme cắt giới hạn, đảm bảo thể tích RE không quá 1/10 thể tích phản ứng.
Các yếu tố khác ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm	Nhiệt độ ủ sai. Dung dịch lai và nước rửa không được ủ ấm trước khi thực hiện. Nhiễm DNA trong bước tách chiết hoặc/và trong hóa chất sử dụng. Tín hiệu lai không đều. ECL quá hạn hoặc ECL không được láng đều trên toàn bộ bề mặt của màng lai. Đánh số, mã đánh dấu lên màng DNA bằng bút bi để phân biệt các file trên hệ thống máy tính.