Kỹ thuật cấy trải trên đĩa thạch (spread plate method): nguyên lý, quy trình thực hiện và ứng dụng trong vi sinh lâm sàng

1. Tổng quan và Mục tiêu của Kỹ thuật Cấy trải

Phương pháp cấy trải (Spread plate method hay Spread plate technique) là kỹ thuật cấy gạt một thể tích xác định huyền phù vi sinh vật lên bề mặt môi trường thạch đã đông đặc hoàn toàn. Khác với kỹ thuật đổ đĩa (Pour plate method), toàn bộ vi sinh vật được cấy trải đều phát triển trên bề mặt đĩa thạch và không nằm vùi bên trong lòng khối thạch.

Các mục tiêu kỹ thuật cốt lõi:

• Trải đều thể tích mẫu: Phân bố một thể tích dịch huyền phù chính xác (thường là 0,1 mL) đồng đều trên bề mặt thạch dinh dưỡng.
• Phân lập khuẩn lạc riêng rẽ: Tạo điều kiện để mỗi tế bào vi khuẩn hoặc nhóm tế bào phân tách độc lập, hình thành các khuẩn lạc rời rạc sau quá trình ủ.
• Định lượng vi sinh vật sống: Tính toán số lượng vi sinh vật sống có khả năng tạo khuẩn lạc, biểu thị dưới đơn vị CFU (Colony-Forming Units).
• Khảo sát đặc tính hình thái: Quan sát chi tiết kích thước, hình dáng, màu sắc, mép rìa, độ nổi và tính chất bề mặt của từng loại khuẩn lạc trên bề mặt thạch.
• Kiểm soát tải lượng vi sinh vật: Phục vụ đánh giá tải lượng vi sinh trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng, kiểm tra vô khuẩn nguồn nước, dược phẩm và bề mặt môi trường phòng bệnh.

2. Nguyên lý Kỹ thuật (Principle of Spread Plate Method)

Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật cấy trải dựa trên sự phân tách cơ học các vi sinh vật sống trên một diện tích bề mặt môi trường thạch cố định:

• Vai trò của độ pha loãng: Mẫu vi sinh vật ban đầu thường có mật độ tế bào rất cao. Nếu cấy trực tiếp, các khuẩn lạc sẽ mọc chen chúc, chồng lấn lên nhau (hiện tượng mọc dày đặc hoặc mọc thảm), không thể đếm hay phân lập được. Pha loãng bậc 10 liên tiếp (10⁻¹, 10⁻², 10⁻³,...) giúp giảm mật độ vi sinh vật xuống mức thích hợp.
• Khái niệm đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU): Một khuẩn lạc quan sát được trên đĩa không nhất thiết phát triển từ một tế bào đơn lẻ. Khuẩn lạc có thể xuất phát từ một tế bào sống, một cặp tế bào, chuỗi, hoặc cụm vi khuẩn liên kết với nhau. Do đó, kết quả định lượng vi sinh vật luôn được tính bằng Đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU - Colony-Forming Unit) chứ không tính là số lượng tế bào tuyệt đối.
• Tính chọn lọc của điều kiện nuôi cấy: Số lượng khuẩn lạc hình thành phụ thuộc mật thiết vào loại môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, thời gian ủ và điều kiện khí trường (hiếu khí, kỵ khí hoặc vi hiếu khí). Kỹ thuật cấy trải chỉ định lượng được các vi sinh vật có khả năng tăng sinh và tạo khuẩn lạc trong điều kiện nuôi cấy cụ thể đó.

Hình 1. Sơ đồ nguyên lý và tiến trình các bước thực hiện kỹ thuật cấy trải trên đĩa thạch.

3. Dụng cụ, Môi trường và Thiết bị Cần thiết

Để đảm bảo quy trình nuôi cấy đạt độ chính xác cao và tránh nhiễm chéo, phòng xét nghiệm vi sinh cần chuẩn bị đầy đủ các trang thiết bị và vật tư sau:

4. Quy trình Thực hành Kỹ thuật Chuẩn (SOP)

Bước 1: Chuẩn bị mẫu và Pha loãng bậc 10 (Serial Dilution)

• Đồng nhất mẫu: Lắc đều ống nghiệm chứa mẫu bệnh phẩm hoặc huyền phù vi khuẩn ban đầu bằng máy vortex để phân tán đồng nhất.
• Pha loãng liên tiếp: Hút 1,0 mL huyền phù gốc cho vào ống nghiệm chứa 9,0 mL dung dịch pha loãng vô trùng (độ pha loãng 10⁻¹). Trộn kỹ.
• Thiết lập dải nồng độ: Tiếp tục hút 1,0 mL từ ống 10⁻¹ chuyển sang ống chứa 9,0 mL dung dịch thứ hai (độ pha loãng 10⁻²). Lặp lại tuần tự để đạt các độ pha loãng mong muốn (10⁻³ đến 10⁻⁶ tùy mật độ mẫu dự đoán).

Bước 2: Tra mẫu lên đĩa thạch (Inoculation)

• Ghi nhãn đĩa: Ghi nhãn rõ ràng ở đáy đĩa Petri: Mã mẫu bệnh phẩm, độ pha loãng, loại môi trường, ngày giờ thực hiện và tên người làm xét nghiệm.
• Tra mẫu chính xác: Sử dụng micropipette với đầu tip vô trùng, hút chính xác 0,1 mL (100 µL) từ độ pha loãng đã chọn và nhỏ nhẹ nhàng vào tâm bề mặt đĩa thạch.

Bước 3: Gạt trải mẫu vi sinh (Spreading)

• Kỹ thuật dùng que gạt hình chữ L: Áp nhẹ phần thân ngang của que gạt L lên bề mặt đĩa thạch. Dùng một tay xoay chậm đĩa Petri (hoặc đặt trên bàn xoay thủ công), tay kia di chuyển que gạt tới lui nhẹ nhàng theo các hướng hình nan quạt để phân bố dung dịch mẫu thành một màng mỏng đều khắp mặt thạch.
• Phương pháp dùng bi thủy tinh (Glass beads): Cho 5–8 viên bi thủy tinh vô trùng vào đĩa đã nhỏ mẫu. Đậy nắp đĩa lại và lắc nhẹ đĩa theo chiều ngang theo chuyển động tròn hoặc tiến - lùi nhiều hướng. Bi thủy tinh sẽ lăn đều và dàn trải dịch mẫu khắp mặt thạch. Sau khi hoàn thành, mở nắp đĩa nghiêng và thu hồi bi vô trùng vào bình chứa.
• Hấp phụ dịch cấy: Để đĩa thạch ở trạng thái đóng nắp trên mặt bàn khoảng 5–10 phút để dịch huyền phù thấm hoàn toàn vào khối thạch trước khi di chuyển.

Bước 4: Ủ ấm và Đọc kết quả (Incubation & Examination)

• Lật ngược đĩa nuôi cấy: Lật ngược đáy đĩa lên trên trước khi đưa vào tủ ấm. Điều này ngăn ngừa hơi nước ngưng tụ trên nắp đĩa nhỏ giọt xuống mặt thạch làm nhòe và lan các khuẩn lạc.
• Thông số ủ tủ ấm: Ủ ở nhiệt độ thích hợp (thường 35–37°C đối với vi khuẩn lâm sàng) trong thời gian quy định (thường từ 24–48 giờ).
• Khảo sát và ghi nhận: Sau thời gian ủ, lấy đĩa ra quan sát hình thái và tiến hành đếm số lượng khuẩn lạc trên các đĩa có mật độ thích hợp.

5. Lưu ý Kỹ thuật và Biện pháp Phòng tránh Sai số

• Đảm bảo bề mặt thạch khô ráo: Bề mặt thạch ẩm ướt sẽ làm vi khuẩn di động lan rộng, kết tụ thành khối mọc thảm thay vì từng khuẩn lạc rời rạc. Cần sấy nhẹ đĩa thạch trong tủ ấm khoảng 15–20 phút trước khi cấy nếu thấy đọng ẩm.
• Nhiệt độ của que gạt: Nếu que gạt thủy tinh được khử trùng bằng cồn và hơ lửa, phải để que nguội hoàn toàn trong không khí vô trùng hoặc làm nguội tại mép thạch trước khi gạt. Que gạt còn nóng sẽ làm chết vi sinh vật, dẫn đến âm tính giả hoặc sai lệch số lượng.
• Khống chế thể tích mẫu: Thể tích mẫu cấy trải không được vượt quá 0,1 mL. Thể tích quá lớn sẽ làm ngập bề mặt thạch, dịch không thể ngấm hết và làm tràn mẫu ra rìa đĩa.
• Tránh làm tổn hại bề mặt thạch: Thao tác gạt mẫu phải nhẹ tay. Dùng lực ấn quá mạnh sẽ làm rách, xước bề mặt thạch, khiến vi khuẩn chui vào các rãnh nứt và phát triển không đồng đều.
• Đảm bảo điều kiện vô trùng: Không mở nắp đĩa Petri quá rộng hoặc quá lâu trong quá trình thao tác để tránh tạp nhiễm vi sinh vật từ không khí phòng xét nghiệm.

6. Đọc và Diễn giải Hình thái Khuẩn lạc Sau Khi Ủ

Sau thời gian nuôi ủ quy chuẩn, đĩa thạch cấy trải có thể xuất hiện 5 dạng kết quả hình thái điển hình như minh họa tại Hình 2:

Hình 2. Minh họa 5 dạng hình thái điển hình trên đĩa thạch cấy trải sau thời gian ủ ấm.

• A. Khuẩn lạc tách rời lý tưởng (Well-separated colonies): Các khuẩn lạc mọc hoàn toàn riêng rẽ, ranh giới rõ ràng, phân bố đồng đều khắp mặt đĩa. Đây là đĩa đạt chuẩn tối ưu để đếm số lượng CFU và chọn bắt khuẩn lạc làm kháng sinh đồ hoặc định danh.
• B. Khuẩn lạc quá dày đặc (Overcrowded colonies): Mật độ vi khuẩn quá cao do độ pha loãng chưa đủ lớn. Các khuẩn lạc mọc chen chúc, chèn ép kích thước của nhau, rất khó đếm chính xác và không dùng để tính toán định lượng.
• C. Mọc lan tỏa / Mọc thảm (Confluent growth): Vi khuẩn mọc thành một lớp thảm liên tục phủ kín mặt thạch, không phân biệt được từng khuẩn lạc riêng lẻ. Nguyên nhân do nồng độ mẫu quá đậm đặc hoặc bề mặt thạch bị ướt làm dịch mẫu hòa lẫn.
• D. Không có khuẩn lạc mọc (No growth): Không ghi nhận khuẩn lạc nào trên đĩa thạch. Có thể do mẫu ban đầu không chứa vi sinh vật sống, que gạt quá nóng làm chết vi khuẩn, môi trường nuôi cấy không phù hợp hoặc tủ ấm hỏng.
• E. Phân bố không đồng đều (Uneven colony distribution): Khuẩn lạc tập trung dồn về một phía mép đĩa hoặc tạo thành các vệt không đều. Nguyên nhân do kỹ thuật gạt que không đều tay hoặc để nghiêng đĩa thạch trước khi dịch kịp ngấm.

7. Phương pháp Tính toán Đơn vị Hình thành Khuẩn lạc (CFU/mL)

Để chuyển đổi số lượng khuẩn lạc đếm được trên đĩa thạch thành mật độ vi sinh vật trong mẫu gốc, kỹ thuật viên áp dụng công thức tiêu chuẩn quốc tế:

CÔNG THỨC TÍNH MẬT ĐỘ VI SINH VẬT:

Mật độ vi sinh vật (CFU/mL) = Số lượng khuẩn lạc đếm được (N)
───────────────────────────────
Độ pha loãng (D) × Thể tích cấy (V tính bằng mL)

Nguyên tắc chọn đĩa đếm tiêu chuẩn:

Theo khuyến cáo của các tiêu chuẩn vi sinh (ISO, FDA-BAM, USP), chỉ chọn đĩa có số lượng khuẩn lạc nằm trong khoảng tin cậy (thường từ 30 đến 300 khuẩn lạc đối với vi khuẩn thông thường). Các đĩa có dưới 30 khuẩn lạc được xem là quá ít (TFTC - Too Few To Count, dễ sai số thống kê), và đĩa trên 300 khuẩn lạc được xem là quá dày (TNTC - Too Numerous To Count, dễ chồng lấn).

Ví dụ tính toán thực tế:

Giả sử phòng xét nghiệm cấy 0,1 mL dịch từ ống pha loãng 10⁻⁴ lên đĩa thạch dinh dưỡng. Sau 24 giờ ủ ở 37°C, số lượng khuẩn lạc đếm được trên đĩa là 85 khuẩn lạc:

• Thông số: Số lượng khuẩn lạc (N) = 85
• Thông số: Độ pha loãng (D) = 10⁻⁴
• Thông số: Thể tích cấy (V) = 0,1 mL
• Áp dụng công thức: CFU/mL = 85 / (10⁻⁴ × 0,1) = 85 / 10⁻⁵ = 8,5 × 10⁶ CFU/mL

Kết luận: Huyền phù vi sinh vật ban đầu có mật độ là 8,5 × 10⁶ CFU/mL trong điều kiện nuôi cấy khảo sát.

8. Đánh giá Ưu điểm và Nhược điểm Kỹ thuật

9. Giá trị Ứng dụng Thực tiễn tại Bệnh viện Nguyễn Tri Phương

Tại Bệnh viện Nguyễn Tri Phương, kỹ thuật cấy trải là một công cụ đắc lực được triển khai thường quy trong nhiều quy trình xét nghiệm và giám sát chuyên môn:

• Chẩn đoán định lượng vi khuẩn niệu: Sử dụng cấy trải định lượng nước tiểu trên đĩa CLED hoặc MacConkey/Blood Agar để xác định tiêu chuẩn nhiễm trùng tiểu (ngưỡng ≥ 10⁵ CFU/mL đối với vi khuẩn gram âm gây bệnh).
• Kiểm soát nhiễm khuẩn môi trường phòng mổ & buồng bệnh: Phối hợp với kỹ thuật dập đĩa hoặc cấy dịch hút/quét để kiểm tra tải lượng vi sinh vật trên bề mặt phòng mổ, bàn phẫu thuật, phòng hồi sức tích cực (ICU) và bàn tay phẫu thuật viên, đảm bảo tuân thủ tiêu chuẩn kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện.
• Kiểm tra chất lượng nguồn nước y tế và nước chạy thận: Định lượng tải lượng vi sinh vật hiếu khí trong các nguồn nước cấp chạy thận nhân tạo (Hemodialysis), nước sinh hoạt bệnh viện và nước rửa tay phẫu thuật viên nhằm đáp ứng nghiêm ngặt các quy chuẩn của Bộ Y tế.
• Nền tảng thực hiện kháng sinh đồ chuẩn hóa: Cấy trải dịch huyền phù vi khuẩn với mật độ chuẩn McFarland 0.5 lên đĩa thạch Mueller-Hinton làm nền tảng thực hiện kỹ thuật kháng sinh đồ khuếch tán đĩa giấy (Kirby-Bauer), phục vụ hướng dẫn phác đồ điều trị kháng sinh hợp lý cho bệnh nhân.

10. Tài liệu Tham khảo (Scientific References)

• Pan, S. (2026). Spread Plate Method: Principle, Procedure, Results and Uses. Biology Notes Online. Truy cập từ: https://biologynotesonline.com/spread-plate-method-principle/
• Sanders, E. R. (2012). Aseptic laboratory techniques: Plating methods. Journal of Visualized Experiments, 63, e3064. https://doi.org/10.3791/3064
• Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., & Pasha, S. S. (2015). Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast CFU enumeration and single colony isolation from diverse samples. Biotechnology Reports, 8, 45–55. https://doi.org/10.1016/j.btre.2015.08.003
• Pakpour, N., & Horgan, S. (2021). Standard plate count. General Microbiology Lab Manual. Biology LibreTexts.
• Bộ Y tế Việt Nam. Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh y học & Tiêu chuẩn kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện.

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

  facebook.com/BVNTP

  youtube.com/bvntp