Quy trình TREC (T cell receptor excision circles): copies/µL: máu thấm khô: Định lượng (PCR và TR-FRET)

 

1. ĐẠI CƯƠNG

1.1. Mục đích của kỹ thuật

Định lượng nồng độ TREC (T cell receptor excision circles) trong máu thấm khô của người.

1.2. Định nghĩa, nguyên lý

Định lượng nồng độ TREC trong máu thấm khô dựa trên khuyếch đại acid nucleic (PCR) và phát hiện sự cộng hưởng năng lượng huỳnh quang theo thời gian (TR-FRET). Định lượng đồng thời TREC (chỉ điểm của suy giảm miễn dịch kết hợp thể nặng, SCID) và beta-actin (dùng để kiểm soát sự khuyếch đại của mẫu). Mẫu máu thấm khô được ủ bằng dung dịch rửa giải để DNA có trong mẫu được giải phóng ra ngoài. Sau đó DNA ban đầu được khuyếch đại tạo ra nhiều bản sao. Cuối cùng, DNA được lai tạo với đầu dò huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang được đo từ đầu dò được lai với TREC (để tính toán kết quả) và beta-actin (để kiểm soát sự khuyếch đại của mẫu).

 

2. CHUẨN BỊ

2.1. Người thực hiện

Nhân lực trực tiếp bao gồm:

- 01 bác sỹ hoặc kỹ thuật y chuyên ngành hóa sinh hoặc xét nghiệm (trình độ đại học);

- 01 kỹ thuật y chuyên ngành hóa sinh hoặc xét nghiệm.

Nhân lực hỗ trợ: y công/ hộ lý, ...

2.2. Vật tư

2.2.1. Dụng cụ, vật tư

- Giấy thấm máu;

- Dụng cụ lấy bệnh phẩm: theo quy trình lấy máu (bông, cồn sát khuẩn, kim chích máu, miếng dán cá nhân, khay kim loại, ...);

- Vật tư tiêu hao tùy theo hệ thống phân tích;

- Pipette tự động/ bán tự động các loại, ví dụ 1000 µL, 200 µL, 10 µL, ...;

- Đầu côn tương ứng các loại pipette tự động/ bán tự động;

- Pipette thủy tinh, quả bóp hút chân không;

- Lọ thủy tinh, cốc thủy tinh;

- Ống đựng mẫu thứ cấp;

- Xe để dụng cụ;

- Giá đựng bệnh phẩm;

- Quần áo blouse, giày dép, mũ, khẩu trang, găng tay;

- Dung dịch khử khuẩn bề mặt, khăn lau, thùng rác, túi rác;

- Dung dịch rửa tay thường, nước sát khuẩn tay nhanh, khăn lau tay.

2.2.2. Hóa chất, sinh phẩm

- Bộ sinh phẩm xét nghiệm định lượng TREC;

- Dung dịch pha loãng mẫu theo khuyến cáo của nhà sản xuất thuốc thử;

- Vật liệu hiệu chuẩn xét nghiệm;

- Vật liệu kiểm tra chất lượng xét nghiệm (nội kiểm, ngoại kiểm);

- Dung dịch hệ thống: nước cất, các loại nước rửa.

Các dụng cụ, vật tư, hóa chất, sinh phẩm có thành phần và điều kiện bảo quản tùy theo nhà sản xuất cụ thể.

2.3. Trang thiết bị

- Hệ thống vận chuyển mẫu tự động;

- Thiết bị tiền xử lý mẫu: máy đục lỗ, máy ly tâm, máy lắc, buồng ủ, tủ sấy, thiết bị thổi khô bằng khí nitơ, tủ an toàn sinh học, máy vortex, máy spindown, ...;

- Hệ thống phân tích mẫu (PCR và TR-FRET);

- Hệ thống lọc nước phục vụ hệ thống phân tích;

- Hệ thống xử lý mẫu hậu phân tích;

- Hệ thống lưu điện;

- Hệ thống máy tính có kết nối hệ thống quản lý thông tin của bệnh viện và của phòng xét nghiệm;

- Các phần mềm phục vụ chuyên môn: HIS, LIS, quản lý chất lượng, quản lý kho, quản lý nhân sự, ...;

- Tủ lạnh thường và tủ lạnh âm sâu để bảo quản hóa chất, mẫu bệnh phẩm;

- Máy in giấy, máy in mã vạch, thiết bị quét mã vạch.

2.4. Chuẩn bị mẫu bệnh phẩm

2.4.1. Đối với quy trình kỹ thuật lấy mẫu bệnh phẩm

- Chuẩn bị người bệnh: người nhà được giải thích về việc lấy mẫu xét nghiệm, phối hợp để lấy mẫu theo đúng yêu cầu.

- Loại mẫu bệnh phẩm: máu thấm khô (được lấy từ gót chân, ngón tay, hoặc cuống rốn, ...) vào bất kỳ thời điểm nào sau sinh.

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu, bảo quản: giấy thấm máu theo khuyến cáo của nhà sản xuất thuốc thử xét nghiệm.

- Điều kiện bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm: tùy theo khuyến cáo của nhà sản xuất thuốc thử xét nghiệm.

- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm (thể tích, số lượng, chất lượng, ...): tùy theo khuyến cáo của nhà sản xuất thuốc thử xét nghiệm.

2.4.2. Đối với quy trình kỹ thuật về thực hiện xét nghiệm

- Loại mẫu bệnh phẩm: dịch chiết tách.

- Dụng cụ chứa mẫu, bảo quản mẫu: ống chứa mẫu ban đầu (ống sơ cấp) và/hoặc ống đựng mẫu dịch được tách ra (ống thứ cấp).

- Điều kiện bảo quản mẫu bệnh phẩm: tùy theo khuyến cáo của nhà sản xuất thuốc thử xét nghiệm.

- Tiêu chuẩn mẫu bệnh phẩm (thể tích, số lượng, chất lượng, ...): tùy theo khuyến cáo của nhà sản xuất thuốc thử xét nghiệm.

2.5. Phiếu chỉ định xét nghiệm

Phiếu yêu cầu xét nghiệm bản giấy hoặc thể hiện trên phần mềm kết nối giữa phòng xét nghiệm và các đơn vị, có đầy đủ thông tin theo quy định của bệnh viện và Bộ Y tế như họ tên, tuổi/ năm sinh, giới tính của bệnh nhân, số giường hoặc địa chỉ, khoa phòng, chẩn đoán, họ tên bác sỹ chỉ định, xét nghiệm cần làm, thời gian chỉ định, họ tên người lấy mẫu, thời gian lấy mẫu và thời gian vận chuyển mẫu đến phòng xét nghiệm, ...

2.6. Thời gian thực hiện kỹ thuật

Ước tính 08 giờ tính từ thời điểm tiếp nhận bệnh phẩm tại phòng xét nghiệm.

2.7. Địa điểm thực hiện kỹ thuật

Địa điểm xét nghiệm: phòng xét nghiệm.

 

3. AN TOÀN

Thực hiện các quy định của Bộ Y tế, bệnh viện và khoa phòng về các vấn đề:

- An toàn sinh học;

- An toàn cho người thực hiện, dự phòng nguy cơ trước và sau phơi nhiễm;

- Bảng dữ liệu an toàn hóa chất có sẵn, cung cấp cho nhân viên khi có yêu cầu;

- An toàn thiết bị và điện, phòng tránh cháy nổ;

- Kiểm soát môi trường (các yếu tố vi khí hậu như nhiệt độ, độ ẩm, ...).

 

4. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

4.1. Các bước thực hiện

4.1.1. Lấy, bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm

- Lấy mẫu theo chỉ định xét nghiệm, tuân thủ đúng quy trình và sử dụng loại giấy thấm theo đúng yêu cầu.

- Thời gian và các điều kiện bảo quản, vận chuyển mẫu áp dụng theo khuyến cáo của nhà sản xuất thuốc thử.

4.1.2. Nhận bệnh phẩm (đối với giao nhận thủ công)

- Kiểm tra mẫu bệnh phẩm đáp ứng các yêu cầu về số lượng, chất lượng, bảo quản, thời gian, điều kiện vận chuyển và lưu trữ mẫu bệnh phẩm.

- Mẫu được ghi thông tin định danh người bệnh và/ hoặc dán mã vạch duy nhất để nhận dạng mẫu.

- Phiếu xét nghiệm có đầy đủ thông tin và mã vạch tương ứng với mẫu.

4.1.3. Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ, hóa chất

- Thiết bị đã được cài chương trình phân tích và được xác nhận giá trị sử dụng phương pháp theo quy định.

- Bảo dưỡng bảo trì thiết bị theo khuyến cáo của nhà sản xuất.

- Chuẩn bị thuốc thử theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

4.1.4. Kiểm tra chất lượng xét nghiệm

- Đảm bảo chất lượng xét nghiệm theo quy định: kết quả nội kiểm phải được đánh giá đạt, khuyến cáo tăng cường chất lượng xét nghiệm bằng ngoại kiểm (mẫu mù, so sánh liên phòng, …).

- Bộ phận giám sát kiểm tra chất lượng phối hợp cùng nhân viên vận hành thiết bị và các bộ phận có liên quan để theo dõi, đánh giá kết quả kiểm tra chất lượng bằng phần mềm quản lý, xử lý trường hợp có kết quả không đạt.

4.1.5. Phân tích mẫu

- Chỉ định xét nghiệm được nhập thủ công, hoặc được chuyển qua hệ thống mạng đến phần mềm quản lý thông tin phòng xét nghiệm có kết nối với máy phân tích.

- Đục mẫu chuẩn, nội kiểm, bệnh phẩm vào các giếng cắt mẫu.

- Chuẩn bị dung dịch thuốc thử và nhỏ vào mỗi giếng.

- Sử dụng tấm dán dán chặt lên toàn bộ bề mặt đĩa và ly tâm đĩa.

- Cho đĩa vào hệ thống phân tích, chạy chương trình được cài đặt nhiệt độ và thời gian theo khuyến cáo của nhà sản xuất hóa chất, thuốc thử.

- Đọc và đánh giá kết quả trên phần mềm chuyên dụng.

- Tiến hành thực hiện lại phân tích mẫu trong trường hợp cần thiết.

- Bệnh phẩm sau khi phân tích được lưu giữ, bảo quản và hủy theo quy định.

- Kết quả được chuyển vào phần mềm quản lý dữ liệu.

4.2. Nhận định kết quả

4.2.1. Xem xét kết quả kiểm tra chất lượng

Xem xét kết quả kiểm tra chất lượng đạt yêu cầu mới đọc kết quả xét nghiệm.

4.2.2. Đọc kết quả

Kết quả xét nghiệm được đọc bằng phần mềm chuyên dụng.

4.2.3. Nhận định kết quả

Nhận định kết quả dựa trên khoảng chuẩn sinh học, giá trị quyết định lâm sàng theo khuyến cáo của cơ quan, tổ chức chuyên ngành, nghiên cứu có uy tín, hoặc công bố của nhà sản xuất về khoảng tham chiếu và ngưỡng xét nghiệm đối với thuốc thử sử dụng trên hệ thống phân tích cụ thể.

Nhà sản xuất hóa chất đưa ra giá trị ngưỡng cho TREC và beta-actin. Ví dụ nhận định như sau:

Vòng đầu tiên:

- TREC ≥ giá trị ngưỡng: nhận định “Bình thường”. Không cần kiểm tra lại.

- TREC < giá trị ngưỡng: nhận định “Có khả năng dương tính”. Làm xét nghiệm vòng thứ hai.

Vòng thứ hai:

- Beta-actin cả hai vòng ≥ giá trị ngưỡng, TREC vòng hai ≥ giá trị ngưỡng: nhận định “Bình thường”.

- Beta-actin cả hai vòng ≥ giá trị ngưỡng, TREC vòng hai < giá trị ngưỡng: nhận định “Có khả năng dương tính”.

- Beta-actin cả hai vòng < giá trị ngưỡng hoặc không đồng nhất giữa hai vòng: nhận định “Kết quả không hợp lệ”. Yêu cầu mẫu mới và xét nghiệm lại. Nếu mẫu thứ hai không kết luận được, lấy mẫu mới sau hai tuần và thử lại.

Ngoài ra, phối hợp các thông tin lâm sàng và các xét nghiệm khác (nếu có) để đánh giá, nhận định kết quả.

4.2.4. Phiên giải và báo cáo kết quả

Phiên giải kết quả dựa vào ngưỡng xét nghiệm, khoảng chuẩn sinh học, giá trị quyết định lâm sàng, ...

Báo cáo kết quả định lượng theo đơn vị copies/µL.

4.2.5. Biện luận kết quả

Ở trẻ sơ sinh đủ tháng có nồng độ TREC thấp hơn giá trị ngưỡng (dương tính), cần theo dõi SCID.

Xét nghiệm có thể dương tính giả ở các mẫu có nồng độ hemoglobin cao, mẫu bị nhiễm bẩn, trẻ bị rối loạn suy giảm miễn dịch như hội chứng DiGeorge, sử dụng thuốc ức chế miễn dịch, trẻ có hệ miễn dịch kém phát triển như trẻ sinh non, ... Có thể âm tính giả ở trẻ sơ sinh mắc SCID do thiếu ADA (adenosine deaminase), đặc biệt những trường hợp khởi phát muộn.

4.3. Trả, tư vấn kết quả và lưu trữ hồ sơ

Kết quả được trả dưới dạng bản ký số chuyển qua mạng, hoặc trả bản giấy.

Tư vấn kết quả xét nghiệm khi có yêu cầu.

Lưu kết quả xét nghiệm và các hồ sơ liên quan như hồ sơ xác nhận giá trị sử dụng phương pháp, theo dõi vận hành bảo dưỡng bảo trì thiết bị, theo dõi số lô, hạn sử dụng thuốc thử, theo dõi kết quả kiểm tra chất lượng xét nghiệm, ...

 

5. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

5.1. Trước khi thực hiện kỹ thuật

Các sai sót có thể xảy ra như sai hoặc thiếu thông tin trên phiếu chỉ định, lấy mẫu sai thời điểm, nhầm bệnh nhân, thời gian và nhiệt độ bảo quản không đúng quy định, ...

Xử trí: lấy, bảo quản, vận chuyển, tiếp nhận và xử lý mẫu theo đúng quy định.

5.2. Trong quá trình thực hiện kỹ thuật

Thực hiện xét nghiệm trong phòng sạch hoặc tủ hút có tia cực tím, thường xuyên làm sạch bằng dung dịch khử khuẩn hoặc cồn.

Việc thực hiện không đúng các bước trong quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất gây sai lệch kết quả. Vì vậy cần tuân thủ đúng các bước trong quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất, thực hiện lại xét nghiệm nếu cần.

Nếu kết quả kiểm tra chất lượng không đạt, cần dừng xét nghiệm không đạt trên hệ thống phân tích, tìm nguyên nhân gốc rễ và khắc phục. Kiểm tra chất lượng lại nếu đạt thì tiếp tục thực hiện xét nghiệm.

5.3. Sau khi thực hiện kỹ thuật

Tiếp nhận và giải quyết các phản hồi từ khách hàng.

 

6. TIÊU CHUẨN ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG

- Thực hiện nội kiểm: tuân theo quy trình đảm bảo chất lượng xét nghiệm của đơn vị;

- Thực hiện ngoại kiểm, hoặc so sánh liên phòng, hoặc kiểm tra mẫu mù, ... : tiến hành tùy theo chương trình.

 

7. TÀI LIỆU THAM KHẢO

- David L. Nelson, Michael M. Cox (2017). Lehninger Principles of Biochemistry. 7^th Edition. W. H. Freeman.

- Donna L. Larson (2017). Clinical Chemistry: Fundamentals and Laboratory Techniques. Elservier.

- William J. Marshall, Marta Lapsley, Andrew P. Day, Ruth M. Ayling (2014). Clinical Biochemistry: Metabolic and Clinical Aspects. 3^rd Edition. Elsevier (Churchill Livingstone).

- Hướng dẫn sử dụng của các hãng sản xuất thiết bị, thuốc thử.