NGUYÊN LÝ
Là kỹ thuật làm tiêu bản và phương pháp nhuộm để phát hiện các bất thường của tổ chức hạch, lách, tủy xương giúp chẩn đoán các bệnh lý tủy xương liên quan.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
01 Kỹ thuật viên hoặc cử nhân kỹ thuật chuyên khoa Huyết học - Truyền máu.
Phương tiện – Hóa chất
Dụng cụ
Máy cắt tiêu bản;
Bàn sấy 37oC;
Kính hiển vi quang học;
Bể nhuộm tiêu bản dung tích 100ml: 06 chiếc;
Bể nhuộm tiêu bản dung tích 200ml: 06 chiếc;
Giá cài tiêu bản vừa bể nhuộm 200ml: 01 chiếc;
Giá gỗ cài tiêu bản: 02 chiếc;
Pipette Pasteur: 04 chiếc;
Gạc thấm nước: 03 chiếc;
Bút chì hoặc bút viết kính: 01 chiếc;
Lamen 22 x 24 hoặc 22 x 22.
Hóa chất
Toluen 1,2,3: để sẵn trong 3 bể nhuộm 100ml;
Cồn tuyệt đối Etylic 1,2,3 để sẵn trong bể nhuộm 100ml;
Cồn 80o pha sẵn và để trong bể 100ml;
Dung dịch Hematoxylin (thành phẩm): để sẵn trong bể 200 ml;
Dung dịch Erythrosin: để sẵn trong bể nhuộm 200 ml;
Axit HCL %: Để trong bể nhuộm 200 ml;
Boom Canada: Lấy ra cốc nhỏ, để trong tủ 60oC.
Cách pha hóa chất
Dung dịch Erythrosin
Erythrosin B (C20H6I4Na2O5): 0,1g
Nước cất: 100ml
Khuấy đều ta được dung dịch Erythrosin B(C20H6I4Na2O5) nồng độ 1‰
Dung dịch Hematoxylin: là hóa chất thành phẩm có trên thị trường.
Dung dịch Hemalun demayer
Công thức:
Alunde K (KAl(SO4)2.12H2O): 5g
Hematine (C6H12O6): 300mg
Acid Acetic (CH3COOH): 5ml
Nước cất: 250ml
Cách pha:
Đun sôi nước cho Alunde K.(KAl(SO4)2.12H2O) vào đun tiếp khoảng 1 - 2 phút cho tan hết, sau đó cho tiếp Hematine (C6H12O6), đun thêm 1 phút và tắt bếp bắc ra để nguội → cho tiếp Acid Acetic (CH3COOH) vào ta được dung dịch Hemalun demayer.
Dung dịch Na2S2O3 5%
Na2S2O3: 5g
Nước cất: 100ml
Lắc đều cho tan hết Na2S2O3 sẽ được dung dịch Na2S2O3 5%.
Dung dịch Na2CO3 1%
Na2CO3: 1g
Nước cất: 100ml
Trộn dung môi và chất tan lẫn nhau, sau đó lắc đều cho tan hết Na2CO3 ta được dung dịch cần pha.
Dung dịch Lugol
Công thức:
KI: 2g
Iốt tinh thể: 1g
Nước cất: 100ml
Cách pha:
Cho KI hòa tan trong nước trước sau đó cho tiếp Iốt tinh thể vào, khuấy đều cho đến khi tan hết ta được dung dịch Lugol.
Bệnh phẩm
Là các tiêu bản mảnh sinh thiết đã cắt sẵn, đảm bảo khô: Sau khi mảnh sinh thiết được đúc thành khuôn, tiến hành cắt dán trên lam kính và để khô trong tủ ấm 37oC trong 3 giờ.
Phiếu xét nghiệm
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Quy trình xử lý bệnh phẩm sinh thiết
Cố định mảnh sinh thiết trong dung dịch (DD) Formol 10% trong 24 giờ;
Chuyển trong hóa chất:
Rửa mẫu trong nước chảy nhẹ trong 1 giờ;
Đẩy nước bằng ngâm trong cồn;
Ngâm trong cồn 90o: 30 phút;
Ngâm trong cồn tuyệt đối I: 1 giờ;
Ngâm trong cồn tuyệt đối II: 1 giờ;
Ngâm trong cồn tuyệt đối II: 3 giờ;
Loại cồn bằng Xylen → lấy mảnh sinh thiết thấm khô bằng giấy thấm
Ngâm trong Xylen I: 30 phút;
Ngâm trong Xylen II: 1 giờ;
Ngâm trong Xylen III: 1 giờ;
Vùi mẫu trong parapin và đúc khuôn.
Lấy mẫu từ Xylen III và thấm khô bằng giấy thấm.
Ngâm trong Parafin nóng chảy trong 12 giờ.
Đúc mảnh sinh thiết trong khuôn Parafin nóng chảy.
Bảo quản khuôn mảnh sinh thiết trong ngăn tủ mát (2oC - 8oC)
Nhuộm Giemsa mảnh sinh thiết
Cắt dán tiêu bản và để khô trong tủ 37oC trong 2 giờ;
Tẩy Parafin bằng cách chuyển mẫu qua Toluen I,II,III → cồn tuyệt đối I,II và cồn 80oC. Mỗi loại 5 phút;
Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ: 5 phút;
Tráng qua cồn tuyệt đối;
Nhuộm Giemsa 1/10: 15 phút;
Rửa dưới nước chảy nhẹ;
Đẩy nước bằng cồn tuyệt đối ngâm trong Toluen;
Gắn lamen và để khô.
Nhuộm HE mảnh sinh thiết hạch, lách.
Tẩy parafin bằng cách chuyển mẫu qua Toluen I, II, III → cồn 80o, cồn tuyệt đối I, II: Mỗi loại 5 phút;
Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;
Nhuộm trong Hematoxylin: 2 - 5 phút;
Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;
Tẩy qua axit HCL 1%: 4 - 8 giây (nếu cần);
Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;
Nhuộm trong Erythrosin: 30 - 60 giây;
Rửa dưới nước chảy nhẹ: 5 phút;
Đẩy nước bằng cồn tuyệt đối → ngâm tiêu bản trong Toluen;
Gắn lamen, để khô và nhận định kết quả.
Nhuộm HE mảnh sinh thiết tủy xương
Chuyển xylen 1,2,3, cồn 1,2 và cồn 80o mỗi loại 5 phút;
Rửa dưới dòng nước chảy 10 phút và rửa sạch paraphin;
Nhuộm Lugol: 10 phút;
Rửa nước chảy: 10 phút;
Nhuộm Na2S2O3: 5 phút;
Rửa dưới dòng nước chảy: 10 phút;
Nhúng vào Hemlundemaye: 4 phút;
Rửa nước chảy: 10 phút;
Tẩy cồn HCL 1 % 8 giây;
Rửa dưới dòng nước chảy 10 phút (nước có sẵn trong cóng);
Làm xanh tiêu bản bằng Na2CO3: 1 phút;
Rửa dưới dòng nước chảy: 10 phút;
Nhúng nền bằng Erythrosin: 2 - 4 giây;
Rửa nước chảy 5 phút;
Gắn lamen: rửa sạch tiêu bản, tráng lại bằng nước cất, tẩy nước bằng cồn tuyệt đối, nhúng qua xylen 1,2,3 (đã để trong tủ ấm) và gắn lamen.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Trên tiêu bản đẹp: thấy rõ các tế bào có đủ nhân, nguyên sinh chất và các hạt của các dòng tế bào. Bên cạnh đó thấy được hình thái và tính chất của tổ chức như lớp vỏ, lớp tủy và các đặc điểm của mỗi phần.
Việc nhận xét hình thái tế bào và tổ chức học đòi hỏi nhân viên phải có kiến thức về Tế bào - Tổ chức học và giải phẫu bệnh. Vì vậy nhân viên làm kỹ thuật quan tâm nhiều đến việc sau khi nhuộm thì các tế bào và cấu trúc tổ chức có bắt màu tốt hay không cũng như các đặc điểm.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Nhuộm các thì hóa chất không phù hợp
Hóa chất đã bị thay đổi nồng độ.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
