HCV genotype Real-time PCR

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích:

Xác định genotype của virus viêm gan C.

Nguyên lý:

Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time RT-PCR.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện:

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành vi sinh.

Phương tiện, hóa chất:

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị:

Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện.

Máy ủ nhiệt.

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.

Máy ly tâm 25000 x g.

Tủ lạnh 2ºC - 8ºC.

Tủ âm sâu (-20ºC) hoặc (-70ºC) (nếu có).

Máy vortex.

Tủ an toàn sinh học.

Micropipettes các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao.

Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 1 mẫu/lần thực hiện (VD).

Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần / 1 năm).

Bệnh phẩm:

Huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần.

Phiếu xét nghiệm:

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm:

Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh (xem phụ lục 3).

Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (xem phụ lục 6).

Tiến hành kỹ thuật:

Bộ sinh phẩm HCV genotype (VD).

Tách chiết RNA.

Thực hiện phản ứng RT-PCR.

Thực hiện bước này với các tube RT-Mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Cho chứng +, chứng - hoặc dịch RNA tách chiết vào tube.

Lập chương trình cho máy PCR hoạt động.

Sản phẩm cDNA được dùng để thực hiện phản ứng PCR.

Nếu chưa thực hiện phản ứng PCR ngay, phải bảo quản cDNA ở (-20oC).

Thực hiện phản ứng real-time PCR.

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

Cho cDNA từ phản ứng RT ở trên (hoặc cDNA của mẫu dương tính trước đó) vào từng tube HCV Genotype 1-6 rPCR Mix và HCV Genotype 2-3 rPCR. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.

Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình real-time PCR.

Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

Chọn màu “FAM” và “HEX” cho tất cả các mẫu, chứng dương và chứng âm.

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.

Lưu file dữ liệu vào máy tính.

Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Điều kiện của phản ứng:

Chứng dương có đường biểu diễn dương tính của màu FAM với genotype 2-6 và màu HEX với genotype 1-3.

Chứng âm có đường biểu âm tính với cả 2 màu.

Phân tích mẫu:

Trong tube HCV Genotype 1-6 rPCR Mix, probe phát hiện genotype 1 được đánh dấu với màu HEX, probe phát hiện genotype 6 được đánh dấu với màu FAM. Trong tube HCV Genotype 2-3 rPCR Mix, probe phát hiện genotype 2 được đánh dấu với màu FAM, probe phát hiện genotype 3 được đánh dấu với màu HEX.

Chọn cả màu FAM và HEX. Mẫu có đường biểu diễn dương tính tương ứng với genotype nào thì kết luận mẫu nhiễm genotype đó. Một mẫu có thể đồng nhiễm nhiều genotype.

In đồ thị kết quả.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Tất cả các mẫu đều dương tính kể cả chứng âm.

Nguyên nhân 1:

Lô thí nghiệm bị ngoại nhiễm RNA hoặc sản phẩm PCR từ môi trường của khu vực thao tác hoặc nhiễm chéo giữa các mẫu.

Khắc phục:

Chiếu UV và vệ sinh khu vực thao tác bằng nước Javel để khử nhiễm. Tiến hành lại thí nghiệm thật cẩn thận.

Nguyên nhân 2:

Kit bị ngoại nhiễm RNA hoặc sản phẩm PCR trong quá trình sử dụng.

Khắc phục:

Thay kit mới và thực hiện quá trình như hướng dẫn ở nguyên nhân.

Trường hợp này không thể lấy kết quả, phải khắc phục và tiến hành lại thí nghiệm.