Mycobacterium tuberculosis đa kháng LPA

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích:

Phát hiện các gene rpoB (mã hóa cho tiểu phần β của RNA polymerase) đột biến mã hóa cho khả năng kháng Rifampicin, gene Kat G (gene mã hóa cho enzyme catalase – peroxidase) đột biến đột biến mã hóa cho khả năng kháng Isoniazid ở mức độ cao trên và gene inhA (mã hóa cho một NADH enoyl ACP reductase) đột biến mã hóa cho khả năng kháng Isoniazid ở mức độ thấp của các chủng M. tuberculosis.

Nguyên lý:

Kỹ thuật Genotype MTBDRplus dựa trên công nghệ LPA (Line Probe Assay) bao gồm kỹ thuật PCR và gắn kết các đoạn gene sau khi được nhân lên vào màng lai (STRIP) đã gắn sẵn các mẫu dò chuyên biệt (oligonucleotide probes). Mẫu dò cho phép xác định vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis complex) có thể liên kết đặc hiệu với các đoạn gene được nhân lên từ các loài thuộc nhóm này.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện:

Người thực hiện cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành vi sinh.

Phương tiện, hóa chất:

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị:

Tủ an toàn sinh học cấp 2.

Tủ thao tác PCR có đèn tím.

Máy ly tâm an toàn (có nắp đậy từng cối) cho tuýp 50ml.

Máy ly tâm lạnh cho tuýp 1.5 ml.

Máy ủ nhiệt khô / ướt.

Máy siêu âm (Ultrasonic).

Máy PCR.

Lò vi sóng (Microwave Oven).

Bộ điện di.

Máy lai GT Blot 20.

Tủ lạnh 4oC và tủ lạnh - 20oC.

Nồi hấp khử trùng.

Tủ sấy.

Máy vortex.

Pipette tự động các loại 10P, 20P, 1000P.

Panh, kẹp (Forceps).

Máy ly tâm mini (Spin down).

Đồng hồ hẹn giờ.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Bệnh phẩm:

Đờm AFB dương tính / âm tính; dịch phế quản, dịch màng phổi, dịch hút khí quản; chủng vi khuẩn nuôi cấy lao môi trường lỏng/đặc.

Phiếu xét nghiệm:

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm:

Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh (xem Phụ lục 2).

Tiến hành kỹ thuật:

Xử lý mẫu bệnh phẩm.

Tách chiết DNA.

Phản ứng khuếch đại.

Lai tự động trên máy GT-blot 20.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

STT	Băng tín hiệu trên thanh STRIP	Trên phiếu dán thanh STRIP	Trên phiếu trả kết quả
1	Vùng đối chứng CC (AC) xuất hiện tín hiệu.
1.1	TUB không hiện bang.	Đánh dấu ở cột TUB “N”.	Không tìm thấy vi khuẩn lao trong mẫu này.
1.2	TUB hiện bang.	Đánh dấu ở cột TUB “P”.	Tìm thấy vi khuẩn lao trong mẫu.
1.2.1	Các vùng đối chứng của rpoB/KatG, inhA không xuất hiện.		Không xác định được có tính kháng R/H hay không.
1.2.2	Các vùng đối chứng của rpoB/KatG, inhA xuất hiện.
1.2.2	Tất cả các dải bănghoang-dại (WT) đều xuất hiện tín hiệu.	Đánh dấu ở cột WT của gene tương ứng là “P”.
STT	Băng tín hiệu trên thanh STRIP	Trên phiếu dán thanh STRIP	Trên phiếu trả kết quả
1	Ít nhất 1 trong số các dải băng-hoang-dại (WT) không xuất hiện tín hiệu.	Đánh dấu ở cột WT của gene tương ứng là “N“.
	Tất cả các băng-đột biến (MUT) đều không xuất hiện tín hiệu.	Đánh dấu ở cột MUT của gene tương ứng “N”.
	Ít nhất 1 trong số các băng-đột-biến (MUT) xuất hiện tín hiệu.	Đánh dấu ở cột MUT của gene tương ứng “P”.
	Ở cột WT của gene tương ứng là “N“ và/hoặc ở cột MUT của gene tương ứng “P”.	Đánh dấu ở cột resistant của gene tương ứng “+”.	Kháng thuốc ở gene tương ứng (R/H).
	Ở cột WT của gene tương ứng là “P “ và ở cột MUT của gene tương ứng “N”	Đánh dấu ở cột sensitive của gene tương ứng “+”.	Nhạy cảm ở gene tương ứng (R/H).
2	Vùng đối chứng CC không xuất hiện tín hiệu.		Không nhận định được kết quả.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Lỗi

Giải thích

Các băng tín hiệu đều yếu kể cả băng

Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ.

Nhiệt độ phòng quá thấp hoặc hóa chất không được đưa về đến nhiệt độ phòng.

Nhiệt độ ủ quá thấp.

Lượng CON-C và/hoặc SUB-C không đủ.

Hóa chất hết hạn.

Các băng tín hiệu đều yếu hoặc không có, trừ băng CC

Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ.

PNM và HotstarTaq DNA Polymerase rã đông quá nhiều lần (tối ưu 5-6 lần)

PNM, HotstarTaq DNA Polymerase và các thành phần khác của Master Mix bị gia nhiệt. Sử dụng hộp giữ lạnh.

Nhiệt độ ủ quá cao hoặc quá thấp.

Độ thuần, tinh sạch trong qúa trình xử lý mẫu.

Có chất ức chế trong quá trình tách DNA ảnh hưởng đến quá trình nhân gene.

Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên agarose 2%. Nếu không thấy có sản phẩm PCR thì lặp lại bước tách chiết DNA và PCR; Nếu xuất hiện băng mờ thì tăng lượng mẫu DNA từ 5ml thành 8ml; Nếu các băng sản phẩm PCR nhòe thì pha loãng lượng mẫu DNA.

Các băng được nhuộm màu không đều

Thanh Strips không hoàn toàn ngập trong dung dịch lai.

Lắc khay có vấn đề trong khi lai.

Màu nền bị đậm

Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ.

CON-C và/hoặc SUB-C quá đậm đặc.

Không đủ dung dịch rửa, bước rửa không sạch.

Dung dịch rửa quá lạnh so với nhiệt độ phòng (25°C).

Phụ thuộc vào lượng DNA đem lai mà mầu nền có thể đậm hơn.

Trong trường hợp này thì ngắt SUB-D ngay khi các băng tín hiệu đã nhìn rõ để tránh bị nhòe băng.

Các yếu tố khác ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm

Nhiệt độ ủ sai.