✴️ Rickettsia Real-time PCR

Nội dung

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích

Phát hiện DNA của Rickettsia Real-time trong mẫu bệnh phẩm máu của người.

Nguyên lý

Phương pháp phát hiện dựa trên nguyên lý Real-time qPCR khuếch đại gen đặc hiệu của các loài vi khuẩn Rickettsia: Orientia tsutsugamushi và Rickettsia typhi.

 

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Máy real-time PCR: Máy Real-time PCR có  ít nhất 04 kênh màu và hệ thống máy vi tính (VD).

Máy tách chiết acid nucleic.

Bộ lưu điện.

Máy ở nhiệt.

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

Máy ly tâm lạnh > 12000 gpm/phút

Tủ lạnh 20C -80C

Tủ âm sâu (-200 C) hoặc (-700C) (nếu có)

Máy vortex

Tủ an toàn sinh học 

Micropipettes các thể tích từ 0,5 µl - 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Huyết tương tách từ máu có chất chống đông EDTA.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

 

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên (VD sử dụng bộ sinh phẩm Rickettsia rPCR Mix hoặc sinh phẩm tương đương).

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

Tiến hành kỹ thuật

Phát hiện vi khuẩn Rickettsia bằng phản ứng Real-time PCR sử dụng Taqman probe.

Thu nhận và xử lý mẫu

Phải tách huyết tương trước khi tách chiết DNA.

Tách chiết DNA 

Thực hiện phản ứng real-time PCR

 

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Điều kiện của phản ứng

Kết quả chấp nhận được nếu cả 3 chứng đạt các điều kiện sau: 

Chứng âm: không phát hiện. 

Chứng dương: nằm trong khoảng cho phép c a nhà sản xuất (đ c hiệu với từng lô thuốc thử). 

Chứng nội: với chứng âm và mẫu có nồng độ thấp (10-1000copies) phải có tín hiệu lên ứng với Ct khoảng 27 đến 30.

Ngược lại kết quả không được chấp nhận nếu không đáp ứng các điều kiện trên và phải thực hiện lại xét nghiệm:

Phân tích mẫu

Mẫu  có tín  hiệu  FAM,  ROX  giá  trị  Ct  ≤ 42  là  mẫu  dương  tính  với Orientia tsutsugamushi

Mẫu có tín hiệu HEX, Cy5, ROX giá trị Ct ≤ 42 là mẫu dương tính với

Rickettsia typhi

Mẫu có tín hiệu Cy5, ROX tín hiệu dương tính với các loài Rickettsia còn lại, không phải 2 loài Orientia tsutsugamushi và Rickettsia typhi.

Mẫu  có tín   hiệu   FAM, HEX, Cy5 giá  trị  Ct >  42  là  mẫu  nghi  ngờ  nên  cần tiến  hành  kiểm  tra  lại  bằng phương pháp chạy điện di sản phẩm PCR, hoặc tách chiết lại DNA khuôn từ mẫu bệnh phẩm và chạy lại Real-time PCR để khẳng định kết quả. 

Mẫu không có tín hiệu FAM, HEX, Cy5 và có tín hiệu ROX là mẫu  âm tính

Mẫu không có tín hiệu FAM, HEX, Cy5, ROX là mẫu bị ức chế, cần tách chiết DNA (có bổ sung nội chuẩn vào mẫu khi tách chiết) và chạy lại Real-time PCR.

 

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Sự cố

Có mẫu và chứng nội cũng đ u âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

Nguyên nhân

Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế. 

Khắc phục

Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu.

Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.

 

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

  facebook.com/BVNTP

  youtube.com/bvntp

Chia sẻ trên Zalo
return to top