MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
Mục đích:
Định danh vi nấm.
NGUYÊN LÝ
Định danh vi nấm bằng kỹ thuật xác định trình tự nucleotide của gen đặc trưng.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện:
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành vi sinh – ký sinh trùng.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành vi sinh – ký sinh trùng.
Phương tiện, hóa chất:
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị:
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy PCR.
Máy đọc điện di.
Máy giải trình tự gen.
Máy ly tâm 16000 vòng / phút.
Máy ủ nhiệt.
Máy vortex.
Micropipette.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm):
Bệnh phẩm:
Chủng nấm đã được nuôi cấy thuần.
Phiếu xét nghiệm:
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm:
Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh.
Tiến hành kỹ thuật:
Tách chiết DNA tổng số.
Thực hiện PCR.
Điện di kiểm tra sản phẩm.
Giải trình tự gen.
Kiểm tra và so sánh trình tự gen của nấm trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự ADN của gen đích không bị nhiễu và phải có độ tương đồng ≥ 90% mới có thể kết luận được loại nấm.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng của primers và master mix, và thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.
Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
