Nhuộm Grocott

NGUYÊN TẮC

Kỹ thuật này dùng để phát hiện nấm, pneumocystis carinii dựa theo nguyên lý kỹ thuật Gomori trong bạc – methenamine. Nguyên lý chung của phản ứng gần giống với nguyên lý trong phản ứng PAS: nhóm các chất phản ứng bị oxy hóa bằng acid chromic hoặc permanganate sẽ tạo ra các aldehyd và người ta có thể phát hiện ra các aldehyd này nhờ vào hiện tượng thủy phân phức chất bạc - methenamine.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 02

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất chung

Dung dịch cố định bệnh phẩm.

Cồn (70^o, 80^o, 95^o, 100^o).

Xylen hay toluen.

Nước cất 2 lần.

Parafin.

Sáp ong.

Albumin + glycerin.

Máy đo độ pH điện tử.

Máy chuyển bệnh phẩm tự động.

Máy đúc khối parafin.

Bàn hơ dùng điện.

Máy cắt lát mỏng (microtome).

Lưỡi dao cắt lát mỏng.

Lò nấu parafin.

Tủ ấm 37^o và 56^o.

Tủ lạnh.

Điều hòa nhiệt độ.

Tủ hốt phòng thí nghiệm.

Nguồn cấp nước chảy.

Bể nhuộm bằng thủy tinh.

Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.

Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.

Khuôn nhựa.

Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).

Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.

Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.

Kẹp không mấu, kéo.

Cân phân tích.

Giấy lọc.

Phiến kính, lá kính.

Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính.

Dung dịch nhựa tổng hợp gắn lá kính.

Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.

Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.

Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật

Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng hoặc pha như hướng dẫn ở III.6.1 dưới đây): dung dịch bạc – methenamin, dung dịch xang lá cây sáng (Vert lumière) SF, dung dịch nước hàn the (borax), acid acetic đậm đặc, dung dịch chlorua vàng.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Cố định

Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 -30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.

Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

Chuyển bệnh phẩm
Vùi parafin
Đúc khối parafin
Cắt và dán mảnh cắt
Nhuộm mảnh cắt

Chuẩn bị phẩm nhuộm

Dung dịch bạc – methenamin

Dung dịch mẹ

Hexamethylen tetramin 3%: 100ml

Bạc nitrat 5%: 5ml

Chú ý: cho từ từ bạc nitrate vào hexamethylen tetramin sẽ được một tủa trắng. Ngay sau đó, tủa này tự hòa tan. Có thể bảo quản dịch ở tủ lạnh trong nhiều ngày.

Dung dịch pha trước khi dùng:

Dung dịch pha trước khi dùng

Tiến hành kỹ thuật

Các mảnh cắt được tẩy parafin qua 3 bể toluen (hoặc xylen), mỗi bể 2 phút

Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút

Rửa trong nước cất 3 - 5 phút

Oxy hóa trong dung dịch acid chromic 5% trong 1giờ

Rửa nước chảy 2 - 3 phút

Rửa trong dung dịch bisunfit Na 1% trong 1phút

Rửa qua nước chảy: 5 - 10 phút

Rửa trong 3 - 4 bể nước cất: mỗi bể 5 lần nhúng

Ngâm trong dung dịch bạc - methenamin ở nhiệt độ 58º khoảng 30 - 60 phút cho đến khi mảnh cắt có màu vàng nâu

Lấy mảnh cắt ra, ngâm trong nước cất. Kiểm tra màu sắc dưới kính hiển vi. - Rửa trong 6 bể nước liên tiếp, mỗi bể 5 lần nhúng.

Thúc trong dung dịch chlorua vàng trong 2 - 5 phút

Rửa trong nước cất

Loại bỏ bạc thừa bằng dung dịch hyposunfit Na 2% trong 2 - 5 phút

Rửa nước thật kỹ

Nhuộm nền bằng xanh lá cây sáng: 30 - 50 giây

Đẩy nước bằng cồn 95° và 100°

Làm trong bằng 3 bể toluen sạch

Gắn lá kính bằng dung dịch nhựa tổng hợp.

KẾT QUẢ

Nấm: màu nâu đen - đen

Chất nền: xanh nhạt

Chất nhầy: màu ghi đậm.

NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

Dung dịch bạc – methenamin là chất oxy hóa có độc tính cao, do đó khi tiếp xúc với dung dịch phải rất cẩn thận, phải đeo khẩu trang, găng tay và phải ở nơi thoáng gió. Có thể giữ dung dịch ở 4°C trong vài tháng.

Khi nhuộm, cần có mảnh cắt chứng đã có thành phần nấm dương tính với phẩm nhuộm này. Nếu mảnh cắt âm tính giả, nên kiểm tra hạn dùng của dung dịch bạc – methenamin để thay dung dịch mới hoặc để thời gian nhuộm lâu hơn.

Trong bước 9 của quy trình nhuộm, dung dịch methenamin được chuẩn bị ngay trước khi sử dụng và cần hâm nóng đến 58°C bằng cách nhanh nhất, mảnh cắt sẽ được tráng màu nâu vàng bằng dung dịch bạc - methenamin và được kiểm tra mức độ bắt màu.

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

facebook.com/BVNTP