GIỚI THIỆU
Xét nghiệm chức năng tiểu cầu là khó, tiêu tốn thời gian và đối diện với hàng loạt các vấn đề gây nhiễu trước khi phân tích.
Trước khi quyết định thực hiện bất cứ xét nghiệm chức năng tiểu cầu nào, cần xem xét:
|
Vấn đề |
Giải thích |
|
Tiền sử và thăm khám lâm sàng |
Một số hội chứng như Hermansky Pudlak syndrome, Cheddiak Higashi syndrome, Wiskott-Aldrich syndrome, Velocardiofacial Syndrome (VCFS), Noonan syndrome, MYH9-related disorders – liên kết với bất thường chức năng tiểu cầu và bạn có thể có một số gợi ý từ việc khai thác tiền sử và thăm khám lâm sàng. |
|
Tiền sử dùng thuốc |
Một lượng lớn thuốc, và một số loại thức ăn có thể tương tác với chức năng tiểu cầu. |
|
Công thức máu (FBC) và phết máu ngoại biên (Blood film) |
Xem xét giảm tiểu cầu giả tạo do ngưng kết lạnh hoặc tiểu cầu vệ tinh. Khoảng 0.1% người khỏe mạnh có giảm tiểu cầu giả tạo liên quan đến EDTA và rất cần thiết loại trừ tình trạng này trước khi tiến hành các xét nghiệm nghiên cứu chức năng xa hơn. Hiện tượng tương tự cũng đã được báo cáo với việc sử dụng citrate và heparin làm chống đông. Một phết máu ngoại biên có thể xác định sự kết chụm tiểu cầu và cung cấp đầu mối chẩn đoán. MPV là một thông số thường bị bỏ qua trong FBC nhưng có thể cung cấp một cách nhìn sâu hơn trong nguyên nhân gây giảm tiểu cầu: Nó có thể là đầu mối chẩn đoán trong một số trường hợp (tiểu cầu lớn di truyền, hội chứng Bernald Soulier) Một người với MPV tăng, đếm tiểu cầu bằng phương pháp miễn dịch có thể chính xác hơn và cho ra kết quả cao hơn hẳn. - MPV có thể cho biết vòng đời của tiểu cầu – một MPV tăng gợi ý tăng thải tiểu cầu như ITP hoặc giảm tiểu cầu thai nghén. MPV có thể giảm trong một số trường hợp của hội chứng Wiskott-Aldrich và một số trường hợp suy tủy xương. Phết máu ngoại biên có thể hữu ích cả trong chẩn đoán giảm tiểu cầu giả tạo cũng như các vấn đề tiểu cầu tiên phát như hội chứng tiểu cầu xám. Trong một số trường hợp giảm tiểu cầu như bất thường May Hegglin – Blood film cho thấy sự hiện diện của thể Dohle (màu xanh xám, hình oval, ưa kiềm, thể vùi ở ngoại vi bào tương tế bào neutrophil) |
NGUYÊN LÝ
Test ngưng tập tiểu cầu đo khả năng hoạt hóa và ngưng tập tiểu cầu – tiểu cầu với các agonist khác nhau trong in vitro. Born aggregometry cổ điển sử dụng huyết tương giàu tiểu cầu, nhưng máu toàn phần cũng có thể sử dụng.
Trong Born aggregometry, PRP được đổ vào cuvette ở 37 độ C, và cuvette được đặt giữa một nguồn sáng và một tế bào quang điện. Khi agonist được cho vào, tiểu cầu ngưng tập, giảm hấp thụ ánh sáng, lượng ánh sáng truyền qua tăng lên và điều này được xác định bởi một tế bào quang điện.
NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN MẬT ĐỘ ÁNH SÁNG XUYÊN QUA
|
Vấn đề |
Giải thích |
|
Những biến đổi tiền phân tích |
Những thuốc có thể tương tác với chức năng tiểu cầu bao gồm aspirin, kháng viêm, kháng tiểu cầu đặc hiệu bao gồm clopidogrel và imidazole. Tuy nhiên, nhiều thuốc vai trò của nó không ức chế chức năng tiểu nhưng thực tế nó vẫn tương tác như kháng sinh, chống trầm cảm, chẹn beta…. Thức ăn: |
|
|
Chế độ ăn giàu chất béo có thể dẫn đến sự hiện diện của chylomicra trong huyết tương và tương tác sự sự xuyên qua ánh sáng trong test aggregometry. Những loại khác như tỏi, nghệ, caffeine. Số lượng tiểu cầu: người có số lượng tiểu cầu quá cao hoặc quá thấp cũng cần được điều chỉnh để trở về khoảng 200-400 x 109/L. Tiểu cầu quá cao có thể điều chỉnh với PPP. Tiểu cầu <200 x 109/L cần được đưa lên để làm giảm tối thiểu mức ảnh hưởng. Mặc dù về logic có thể ly tâm tăng cường ở trường hợp tiểu cầu cao, nhưng việc này có thể dẫn đến hoạt hóa tiểu cầu, nên không được khuyến cáo. Nhiệt độ: Mẫu máu cho test này nên được lưu trữ ở nhiệt độ phòng pH: Ngưng tập tiểu cầu nên được thực hiện ở pH sinh lý. Nồng độ fibrinogen: Tiểu cầu chỉ có thể ngưng tập (mặc dù nó có thể kết dính) nếu fibrinogen có mặt, vì vậy rất quan trọng phải kiểm tra mức fibrinogen trước khi thực hiện test aggregometry. Chống đông: Những guideline hiện tại đề nghị rằng mẫu cho test aggregometry cần được thu thập trong citrate. Tuy nhiên, những dữ liệu gần đây cho thấy heparin có thể bảo quản tiểu cầu trong 24 giờ. |
|
Chuẩn bị huyết tương giàu tiểu cầu (PRP) |
Tiểu cầu rất nhạy và có thể sẵn sàng hoạt hóa trong quá trình chuẩn bị PRP Chống đông: Máu tĩnh mạch được thu thập trong ống 3.2%/0.109M citrate theo tỉ lệ 1:9 Máu toàn phần nên được xử lý trong vòng 4 giờ Mẫu máu cho test aggregometry nên được giữ ở nhiệt độ phòng – làm lạnh có thể dẫn đến hoạt hóa tiểu cầu. Vận chuyển mẫu đến LABO tại nhiệt độ phòng. PRP được chuẩn bị bằng cách ly tâm tại 20 độ C, 150-200g, khoảng 10-15 phút. PRP được loại bỏ một cách cẩn thận và đặt trong một ống nhựa đậy nắp. PRP nên được lưu trữ ở nhiệt độ phòng. PPP cũng có thể được chuẩn bị bằng cách ly tâm 2700g trong 15 phút. |
|
Agonist |
Thêm các agonist tiểu cầu vào PRP dẫn đến hoạt hóa tiểu cầu, thay dổi hình dạng từ dạng đĩa thành dạng hình cầu có gai, liên kết với sự tăng mật độ ánh sáng xuyên qua. Chỉ có 2 ngoại lệ là epinephrine, nó không gây thay đổi hình dạng và ristocetin nó gây kết dính chứ không phải ngưng tập (không gắn với fibrinogen). Có 2 type agonist: Agonist mạnh: như collagen, thrombin, TxA2; chúng trực tiếp gây ngưng tập tiểu cầu, tổng hợp TxA2 và bài tiết hạt trong tiểu cầu. Agonist yếu: như ADP, epinephrine; chúng dẫn đến ngưng tập nhưng không gây bài tiết. Việc bài tiết cũng có thể xảy ra sau ngưng tập đối với các agonist yếu, khi sự tổng hợp TxA2 nội sinh được khởi động nhờ tương tác tiểu cầu – tiểu cầu xảy ra trong quá trình ngưng tập. Những agonist mạnh, khi dùng với nồng độ thấp, có thể hoạt động như agonist yếu, nhưng những agonist yếu, thậm chí khi dùng ở nồng độ cao, cũng không thể tạo ra hoạt tính như agonist mạnh. Một số agonist yếu, ở nồng độ tới hạn, đường cong ngưng tập tiểu cầu sẽ có dạng sóng 2 pha: pha ngưng tập tiên phát và pha ngưng tập thứ phát (thường không thuận nghịch). Sóng ngưng tập thứ phát có thể không xảy ra và sóng tiên phát có thể tan rã trở lại. Ở nồng độ cao (trừ epinephrine) 2 sóng ngưng tập kết hợp lại và chỉ nhìn thấy 1 sóng và dạng sóng 2 pha biến mất. Đáp ứng ngưng tập với agonist sẽ được khuyếch đại bằng việc tạo ra TxA2 từ màng phospholipid và sự bài tiết ADP từ hạt đậm đặc (vì ADP và TxA2 chính là các agonist) |
NHỮNG AGONIST ĐƯỢC SỬ DỤNG PHỔ BIẾN TRONG LTA
Trong thực hành, nhiều LABO sử dụng một số agonist cũng như một số độ pha loãng khác nhau, tuy nhiên việc lựa chọn agonist cũng như nồng độ của nó phụ thuộc vào kết quả của test ban đầu cũng như bất thường nghi ngờ. Không phải tất cả LABO bắt buộc phải sử dụng các mức nồng độ như trong bảng dưới.
|
Agonist |
Nồng độ làm việc |
Bình luận |
|
ADP |
Liều thấp: 2.5, 5µM Liều cao: 10µM |
ADP gắn với receptor tương ứng trên bề mặt tiểu cầu. Kết quả gắn ban đầu sẽ dẫn đến việc bài tiết calcium nội bào, làm thay đổi hình dáng tiểu cầu và tạo ra sóng ngưng tập tiên phát. Sóng thứ phát phản ứng sự tiết ADP từ hạt tiểu cầu. ADP liều thấp chỉ tạo ra sóng tiên phát và có thể đảo ngược. ADP và arachidonic acid được xem như các agonist nhẹ. ADP gắn vào 2 receptor G-protein: P2Y1 và P2Y12. ADP gắn với P2Y1 dẫn đến hình dạng và khởi động sóng nguyên phát thông qua huy động calcium. P2Y12 được xem như repceptor thuộc loại “major” và chịu trách nhiệm cho việc ngưng tập tiểu cầu toàn diện nhờ ức chế adenyl cyclase. P2Y12 cũng là đích của clopidogrel. Với cả ADP và Arachidonic acid, sóng thứ phát bị ức chế bởi aspirin và NSAID. |
|
Collagen |
1.4 µg/mL |
Collagen gắn với receptor GpVI và GpIa/IIa dẫn đến phóng thích hạt, tổng hợp TxA2 và sau đó hoạt hóa GpIIb/IIIa dai dẳng. |
|
|
|
GpIa/IIa receptor liên quan đến kết dính tiểu cầu. GpVI receptor liên quan đến tín hiệu nội bào và tổng hợp TXA2. Một pha chậm được quan sát khi cho collagen vào PRP và thường <1 phút. |
|
Ristocetin |
Liều thấp: 0.5mg/dl Liều cao: 1.5, 5mg/dl |
Ristocetin liều cao sẽ gây ra kết dính tiểu cầu thông qua VWF và phức hợp GpIb-IX-V (không gây ra ngưng tập được). Liều thấp không gây ra kết dính được. |
|
Adrenalin |
5, 10 µM |
Adrenalin gắn với receptor α2-adrenergic trên bề mặt tiểu cầu dẫn đến sự ức chế adenyl cyclase và bài tiết calcium. Ngưng tập tiểu cầu với adrenaline là tương tự với ADP khi khởi đầu sóng tiên phát, sự tiết ADP từ hạt đặc tiểu cầu tạo ra sóng ngưng tập thứ phát bền vững. Như ADP, sóng thứ 2 sẽ bị ức chế bởi aspirin và NSAID. Adrenaline được xem như agonist yếu. Tuy nhiên, khiếm khuyết tín hiệu thông qua α2adrenergic liên kết với rối loạn chảy máu. Một tỷ lệ nhỏ dân số không luôn luôn tạo ra ngưng tập đầy đủ với adrenalin do sự biến động tự nhiên trong số thụ thể của adrenaline. |
|
Acid arachidonic |
500 µg/mL |
Arachidonic acid là tiền thân của TXA2 trong tiểu cầu. Arachidonic acid được chuyển thành TXA2 bởi Cyclooxygenase và thromboxane synthase. TXA2 là chất cảm ứng cho ngưng tập tiểu cầu bằng việc phóng thích hạt, nhiều TXA2 được tạo ra hơn và dẫn đến hoạt hóa GpIIb-IIIa dai dẳng. |
|
Thrombin |
Liều thấp: 50nmol/L Liều cao: 100nmol/L |
Thrombin là chất hoạt hóa sinh lý tiềm năng nhất của tiểu cầu và PAR1 (Protease-activated Receptor), PAR4. PAR1 và PAR4 là thành viên của nhóm thụ thể bắt cặp với G-protein xuyên màng 7 lần (G protein–coupled receptor) được hoạt hóa bằng cách cắt domain đầu N tận, tạo ra đầu N tận mới => hoạt hóa tiểu đơn vị G và tín hiệu nội bào. Thrombin tạo ra ngưng tập tiểu cầu ở liều thấp nhưng liều này thì không đủ tạo ra sự ngưng tập đầy đủ. Ở nồng độ cao hơn sẽ ngưng tập đủ. |
PHƯƠNG PHÁP
|
Bước |
|
|
1 |
Aggregometry được thực hiện tại 37 độ C. |
|
2 |
Máy Aggregometer được chuẩn hóa bởi: Một đường cong chứa PRP với 0% ánh sáng truyền qua Một đường cong thứ 2 chứa PPP với 100% ánh sáng truyền qua |
|
3 |
Tiểu cầu chỉ ngưng tập nếu chúng được hoạt hóa (với agonist) và tiếp xúc với nhau – vì vậy chúng phải được khuấy trong khi test diễn ra. Nếu không khuấy sẽ dẫn tới không hoặc giảm đáng ngưng tập tiểu cầu. Kiểm tra ngưng kết tiểu cầu tự động (SPT – Spontaneous Platelet Aggregation): SPT hiếm khi xảy ra ở người bình thường, nhưng gặp trong một số trường hợp VWD, đái tháo đường, rối loạn lipid máu và nhiều rối loạn khác, vì vậy nên được làm ở mọi trường hợp bằng cách cho PRP chưa pha loãng vào máy aggregometer và khuấy trong 15 phút. Trong trường hợp SPA, pha loãng PRP có thể loại bỏ hiện tượng này, và nếu số lượng TC vẫn >200 x 109/L thì test ngưng tập có thể tiếp tục |
|
4 |
Nhìn chung, 270µL PRP được thêm vào cuvette của aggregometry và ủ ấm ở 37 độ C cho tới khi đạt đường ổn định. 30µL agonist được thêm vào và đáp ứng được ghi lại Test được lặp lại với một panel các agonist. |
Qũy đạo ngưng tập sau cho thấy hiện tượng ngưng tập hai pha kinh điển.
1. Đường mức nền (Baseline).
2. Thêm agonist – điều này dẫn đến thay đổi hình dạng tiểu cầu, giảm hấp thụ ánh sáng.
3. Sóng thứ 1 (tiên phát).
4. Tiết nucleotide.
5. Sóng ngưng tập thứ phát .
Adrenaline và ADP liều thấp cho đường cong ngưng tập 2 pha kinh điển trong khi đó những agonist khác chỉ có sóng đơn, không thể phân biệt sóng thứ 1 khỏi sóng thứ 2.
PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
Tính toán hệ số góc hoặc tốc độ ngưng tập.
Trước đây, phần trăm ngưng tập cực đại được báo cáo khi phân tích đường cong ngưng tập. Để tính % ngưng tập cực đại, ta lấy khoảng cách từ baseline đến mức ngưng tập cực đại (X) chia cho khoảng cách từ baseline đến mức ngưng tập 100% (Y).
Hiện nay ta tính qua độ dốc (slope = hệ số góc). Lập tỷ số X/Y.
Phân tích quỹ đạo ngưng tập tiểu cầu.
Diễn giải quỹ đạo ngưng tập tiểu cầu là một vấn đề khó. Một số bất thường được khảo sát gồm:
Bệnh Glanzmann (hoặc afibrinogenaemia).
Hội chứng Bernald-Soulier (hoặc VWD).
Rối loạn kho chứa (hoặc khiếm khuyết bài tiết).
Ảnh hưởng của Aspirin (hoặc khiếm khuyết giống aspirin).
Ảnh hưởng của Clopidogrel.
Quỹ đạo ngưng tập của một số rối loạn được vẽ dưới đây. Chứng: màu xanh, bệnh nhân: màu đỏ.
Bất thường duy nhất là không kết dính với ristocetin. Có thể VWD hoặc BSS.
Ngược với tình trạng trên, chỉ duy nhất kết dính tiểu cầu với ristocetin diễn ra. Không ngưng tập được với ADP, Adrenaline hoặc collagen. Chẩn đoán có thể là bệnh Glanzmann hoặc afibrinogenaemia. Nhớ rằng, kết dính tiểu cầu với ristocetin xảy ra không phụ thuộc vào fibrinogen.
Ở bệnh nhân này, sóng thứ 1 quan sát được với ADP, Adrenaline và Collagen và chỉ kết dính một phần với ristocetin. Điều này gợi ý suy giảm khả năng tiết trong bối cảnh hoặc rối loạn kho chứa hoặc kiếm khuyết tiết nucleotide.
Tóm tắt:
|
Rối loạn |
Đặc điểm LTA |
|
Glanzmann's Thrombasthenia HOẶC afibrinogenaemia |
Vắng hoặc giảm ngưng tập đáng kể với tất cả agonist trừ ristocetin. Với ristocetin chỉ xảy ra kết dính tương ứng sóng nguyên phát, không xảy ra ngưng tập được. |
|
Bernard Soulier Syndrome HOẶC Von Willebrand Disease |
Vắng hoặc giảm đáng kể kết dính tiểu cầu với ristocetin |
|
Rối loạn kho chứa HOẶC khiếm khuyết bài tiết |
Chỉ ngưng tập tiên phát với ADP, Adrenalin, Collagen và kết dính một phần với ristocetin |
|
Aspirin (hoặc khiếm khuyết con đường COX) |
Không ngưng tập với arachidonic acid Chỉ ngưng tập tiên phát với ADP Giảm hoặc không ngưng tập với Collagen. |
|
Clopidogrel |
Không ngưng tập với ADP |
|
2B VWD hoặc bệnh giả VWD |
Ngưng tập với ristocetin liều thấp. |
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Haberichter SL, Balistreri M, Christopherson P, Morateck P, Gavazova S, Bellissimo DB, et al. Assay of the von Willebrand factor (VWF) propeptide to identify patients with type 1 von Willebrand disease with decreased VWF survival. Blood. 2006 Nov 15;108(10):3344-51.
Nossent AY, V VANM, NH VANT, Rosendaal FR, Bertina RM, JA VANM, et al. von Willebrand factor and its propeptide: the influence of secretion and clearance on protein levels and the risk of venous thrombosis. J Thromb Haemost. 2006 Dec;4(12):2556-62.
Sztukowska M, Gallinaro L, Cattini MG, Pontara E, Sartorello F, Daidone V, et al. Von Willebrand factor propeptide makes it easy to identify the shorter Von Willebrand factor survival in patients with type 1 and type Vicenza von Willebrand disease. Br J Haematol. 2008 Sep;143(1):107-14.
Gadisseur A, Berneman Z, Schroyens W, Michiels JJ. Laboratory diagnosis of von Willebrand disease type 1/2E (2A subtype IIE), type 1 Vicenza and mild type 1 caused by mutations in the D3, D4, B1-B3 and C1-C2 domains of the von Willebrand factor gene. Role of von Willebrand factor multimers and the von Willebrand factor propeptide/antigen ratio. Acta Haematol. 2009;121(2-3):128-38.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
