✴️ Các xét nghiệm đông máu: Light transmission aggregomeytry (LTA)

Vấn đề

Giải thích

Tiền sử và thăm khám lâm sàng

Một số hội chứng như Hermansky Pudlak syndrome,

Cheddiak Higashi syndrome, Wiskott-Aldrich syndrome,

Velocardiofacial Syndrome (VCFS), Noonan syndrome,

MYH9-related disorders – liên kết với bất thường chức năng tiểu cầu và bạn có thể có một số gợi ý từ việc khai thác tiền sử và thăm khám lâm sàng.

Tiền sử dùng thuốc

Một lượng lớn thuốc, và một số loại thức ăn có thể tương tác với chức năng tiểu cầu.

Công thức máu (FBC) và phết máu ngoại biên

(Blood film)

Xem xét giảm tiểu cầu giả tạo do ngưng kết lạnh hoặc tiểu cầu vệ tinh. Khoảng 0.1% người khỏe mạnh có giảm tiểu cầu giả tạo liên quan đến EDTA và rất cần thiết loại trừ tình trạng này trước khi tiến hành các xét nghiệm nghiên cứu chức năng xa hơn. Hiện tượng tương tự cũng đã được báo cáo với việc sử dụng citrate và heparin làm chống đông. Một phết máu ngoại biên có thể xác định sự kết chụm tiểu cầu và cung cấp đầu mối chẩn đoán.

MPV là một thông số thường bị bỏ qua trong FBC nhưng có thể cung cấp một cách nhìn sâu hơn trong nguyên nhân gây giảm tiểu cầu:

Nó có thể là đầu mối chẩn đoán trong một số trường hợp (tiểu cầu lớn di truyền, hội chứng Bernald Soulier)

Một người với MPV tăng, đếm tiểu cầu bằng phương pháp miễn dịch có thể chính xác hơn và cho ra kết quả cao hơn hẳn. - MPV có thể cho biết vòng đời của tiểu cầu – một MPV tăng gợi ý tăng thải tiểu cầu như ITP hoặc giảm tiểu cầu thai nghén.

MPV có thể giảm trong một số trường hợp của hội chứng Wiskott-Aldrich và một số trường hợp suy tủy xương.

Phết máu ngoại biên có thể hữu ích cả trong chẩn đoán giảm tiểu cầu giả tạo cũng như các vấn đề tiểu cầu tiên phát như hội chứng tiểu cầu xám. Trong một số trường hợp giảm tiểu cầu như bất thường May Hegglin – Blood film cho thấy sự hiện diện của thể Dohle (màu xanh xám, hình oval, ưa kiềm, thể vùi ở ngoại vi bào tương tế bào neutrophil)

Vấn đề

Giải thích

Những biến đổi tiền phân tích

Những thuốc có thể tương tác với chức năng tiểu cầu bao gồm aspirin, kháng viêm, kháng tiểu cầu đặc hiệu bao gồm clopidogrel và imidazole. Tuy nhiên, nhiều thuốc vai trò của nó không ức chế chức năng tiểu nhưng thực tế nó vẫn tương tác như kháng sinh, chống trầm cảm, chẹn beta….

Thức ăn:

Chế độ ăn giàu chất béo có thể dẫn đến sự hiện diện của chylomicra trong huyết tương và tương tác sự sự xuyên qua ánh sáng trong test aggregometry.

Những loại khác như tỏi, nghệ, caffeine.

Số lượng tiểu cầu: người có số lượng tiểu cầu quá cao hoặc quá thấp cũng cần được điều chỉnh để trở về khoảng 200-400 x 109/L. Tiểu cầu quá cao có thể điều chỉnh với PPP. Tiểu cầu <200 x 109/L cần được đưa lên để làm giảm tối thiểu mức ảnh hưởng. Mặc dù về logic có thể ly tâm tăng cường ở trường hợp tiểu cầu cao, nhưng việc này có thể dẫn đến hoạt hóa tiểu cầu, nên không được khuyến cáo.

Nhiệt độ: Mẫu máu cho test này nên được lưu trữ ở nhiệt độ phòng

pH: Ngưng tập tiểu cầu nên được thực hiện ở pH sinh lý.

Nồng độ fibrinogen: Tiểu cầu chỉ có thể ngưng tập (mặc dù nó có thể kết dính) nếu fibrinogen có mặt, vì vậy rất quan trọng phải kiểm tra mức fibrinogen trước khi thực hiện test aggregometry.

Chống đông: Những guideline hiện tại đề nghị rằng mẫu cho test aggregometry cần được thu thập trong citrate. Tuy nhiên, những dữ liệu gần đây cho thấy heparin có thể bảo quản tiểu cầu trong 24 giờ.

Chuẩn bị huyết tương giàu tiểu cầu (PRP)

Tiểu cầu rất nhạy và có thể sẵn sàng hoạt hóa trong quá trình chuẩn bị PRP

Chống đông: Máu tĩnh mạch được thu thập trong ống 3.2%/0.109M citrate theo tỉ lệ 1:9

Máu toàn phần nên được xử lý trong vòng 4 giờ

Mẫu máu cho test aggregometry nên được giữ ở nhiệt độ phòng – làm lạnh có thể dẫn đến hoạt hóa tiểu cầu.

Vận chuyển mẫu đến LABO tại nhiệt độ phòng. PRP được chuẩn bị bằng cách ly tâm tại 20 độ C, 150-200g, khoảng 10-15 phút. PRP được loại bỏ một cách cẩn thận và đặt trong một ống nhựa đậy nắp. PRP nên được lưu trữ ở nhiệt độ phòng. PPP cũng có thể được chuẩn bị bằng cách ly tâm 2700g trong 15 phút.

Agonist

Thêm các agonist tiểu cầu vào PRP dẫn đến hoạt hóa tiểu cầu, thay dổi hình dạng từ dạng đĩa thành dạng hình cầu có gai, liên kết với sự tăng mật độ ánh sáng xuyên qua. Chỉ có 2 ngoại lệ là epinephrine, nó không gây thay đổi hình dạng và ristocetin nó gây kết dính chứ không phải ngưng tập (không gắn với fibrinogen).

Có 2 type agonist: 

Agonist mạnh: như collagen, thrombin, TxA2; chúng trực tiếp gây ngưng tập tiểu cầu, tổng hợp TxA2 và bài tiết hạt trong tiểu cầu.

Agonist yếu: như ADP, epinephrine; chúng dẫn đến ngưng tập nhưng không gây bài tiết. Việc bài tiết cũng có thể xảy ra sau ngưng tập đối với các agonist yếu, khi sự tổng hợp TxA2 nội sinh được khởi động nhờ tương tác tiểu cầu – tiểu cầu xảy ra trong quá trình ngưng tập.

Những agonist mạnh, khi dùng với nồng độ thấp, có thể hoạt động như agonist yếu, nhưng những agonist yếu, thậm chí khi dùng ở nồng độ cao, cũng không thể tạo ra hoạt tính như agonist mạnh.

Một số agonist yếu, ở nồng độ tới hạn, đường cong ngưng tập tiểu cầu sẽ có dạng sóng 2 pha: pha ngưng tập tiên phát và pha ngưng tập thứ phát (thường không thuận nghịch). Sóng ngưng tập thứ phát có thể không xảy ra và sóng tiên phát có thể tan rã trở lại. Ở nồng độ cao (trừ epinephrine) 2 sóng ngưng tập kết hợp lại và chỉ nhìn thấy 1 sóng và dạng sóng 2 pha biến mất.

Đáp ứng ngưng tập với agonist sẽ được khuyếch đại bằng việc tạo ra TxA2 từ màng phospholipid và sự bài tiết ADP từ hạt đậm đặc (vì ADP và TxA2 chính là các agonist) 

Agonist

Nồng độ làm việc

Bình luận

ADP

Liều thấp: 2.5, 5µM

Liều cao: 10µM

ADP gắn với receptor tương ứng trên bề mặt tiểu cầu. Kết quả gắn ban đầu sẽ dẫn đến việc bài tiết calcium nội bào, làm thay đổi hình dáng tiểu cầu và tạo ra sóng ngưng tập tiên phát. Sóng thứ phát phản ứng sự tiết ADP từ hạt tiểu cầu.

ADP liều thấp chỉ tạo ra sóng tiên phát và có thể đảo ngược. ADP và arachidonic acid được xem như các agonist nhẹ.

ADP gắn vào 2 receptor G-protein: P2Y1 và P2Y12. ADP gắn với P2Y1 dẫn đến hình dạng và khởi động sóng nguyên phát thông qua huy động calcium.

P2Y12 được xem như repceptor thuộc loại “major” và chịu trách nhiệm cho việc ngưng tập tiểu cầu toàn diện nhờ ức chế adenyl cyclase.

P2Y12 cũng là đích của clopidogrel. Với cả ADP và Arachidonic acid, sóng thứ phát bị ức chế bởi aspirin và NSAID.

Collagen

1.4 µg/mL

Collagen gắn với receptor GpVI và GpIa/IIa dẫn đến phóng thích hạt, tổng hợp TxA2 và sau đó hoạt hóa GpIIb/IIIa dai dẳng. 

GpIa/IIa receptor liên quan đến kết dính tiểu cầu. GpVI receptor liên quan đến tín hiệu nội bào và tổng hợp TXA2.

Một pha chậm được quan sát khi cho collagen vào PRP và thường <1 phút.

Ristocetin

Liều thấp: 0.5mg/dl

Liều cao: 1.5, 5mg/dl

Ristocetin liều cao sẽ gây ra kết dính tiểu cầu thông qua VWF và phức hợp GpIb-IX-V (không gây ra ngưng tập được). Liều thấp không gây ra kết dính được.

Adrenalin

5, 10 µM

Adrenalin gắn với receptor α2-adrenergic trên bề mặt tiểu cầu dẫn đến sự ức chế adenyl cyclase và bài tiết calcium. Ngưng tập tiểu cầu với adrenaline là tương tự với ADP khi khởi đầu sóng tiên phát, sự tiết ADP từ hạt đặc tiểu cầu tạo ra sóng ngưng tập thứ phát bền vững. Như ADP, sóng thứ 2 sẽ bị ức chế bởi aspirin và NSAID. Adrenaline được xem như agonist yếu. Tuy nhiên, khiếm khuyết tín hiệu thông qua α2adrenergic liên kết với rối loạn chảy máu.

Một tỷ lệ nhỏ dân số không luôn luôn tạo ra ngưng tập đầy đủ với adrenalin do sự biến động tự nhiên trong số thụ thể của adrenaline.

Acid arachidonic 

500 µg/mL

Arachidonic acid là tiền thân của TXA2 trong tiểu cầu. Arachidonic acid được chuyển thành TXA2 bởi Cyclooxygenase và thromboxane synthase. TXA2 là chất cảm ứng cho ngưng tập tiểu cầu bằng việc phóng thích hạt, nhiều TXA2 được tạo ra hơn và dẫn đến hoạt hóa GpIIb-IIIa dai dẳng.

Thrombin

Liều thấp: 50nmol/L

Liều cao: 100nmol/L

Thrombin là chất hoạt hóa sinh lý tiềm năng nhất của tiểu cầu và PAR1 (Protease-activated Receptor), PAR4. PAR1 và PAR4 là thành viên của nhóm thụ thể bắt cặp với G-protein xuyên màng 7 lần (G protein–coupled receptor) được hoạt hóa bằng cách cắt domain đầu N tận, tạo ra đầu N tận mới => hoạt hóa tiểu đơn vị G và tín hiệu nội bào.

Thrombin tạo ra ngưng tập tiểu cầu ở liều thấp nhưng liều này thì không đủ tạo ra sự ngưng tập đầy đủ. Ở nồng độ cao hơn sẽ ngưng tập đủ.

Bước 

1

Aggregometry được thực hiện tại 37 độ C.

2

Máy Aggregometer được chuẩn hóa bởi:

Một đường cong chứa PRP với 0% ánh sáng truyền qua

Một đường cong thứ 2 chứa PPP với 100% ánh sáng truyền qua

3

Tiểu cầu chỉ ngưng tập nếu chúng được hoạt hóa (với agonist) và tiếp xúc với nhau – vì vậy chúng phải được khuấy trong khi test diễn ra. Nếu không khuấy sẽ dẫn tới không hoặc giảm đáng ngưng tập tiểu cầu.

Kiểm tra ngưng kết tiểu cầu tự động (SPT – Spontaneous Platelet Aggregation): SPT hiếm khi xảy ra ở người bình thường, nhưng gặp trong một số trường hợp VWD, đái tháo đường, rối loạn lipid máu và nhiều rối loạn khác, vì vậy nên được làm ở mọi trường hợp bằng cách cho PRP chưa pha loãng vào máy aggregometer và khuấy trong 15 phút. Trong trường hợp SPA, pha loãng PRP có thể loại bỏ hiện tượng này, và nếu số lượng TC vẫn >200 x 109/L thì test ngưng tập có thể tiếp tục

4

Nhìn chung, 270µL PRP được thêm vào cuvette của aggregometry và ủ ấm ở 37 độ C cho tới khi đạt đường ổn định.

30µL agonist được thêm vào và đáp ứng được ghi lại Test được lặp lại với một panel các agonist.

Rối loạn

Đặc điểm LTA

Glanzmann's

Thrombasthenia

HOẶC

afibrinogenaemia

Vắng hoặc giảm ngưng tập đáng kể với tất cả agonist trừ ristocetin. Với ristocetin chỉ xảy ra kết dính tương ứng sóng nguyên phát, không xảy ra ngưng tập được.

Bernard Soulier

Syndrome HOẶC

Von Willebrand

Disease

Vắng hoặc giảm đáng kể kết dính tiểu cầu với ristocetin

Rối loạn kho chứa

HOẶC

khiếm khuyết bài tiết

Chỉ ngưng tập tiên phát với ADP, Adrenalin, Collagen và kết dính một phần với ristocetin 

Aspirin (hoặc khiếm khuyết con đường COX)

Không ngưng tập với arachidonic acid

Chỉ ngưng tập tiên phát với ADP

Giảm hoặc không ngưng tập với Collagen.

Clopidogrel 

Không ngưng tập với ADP

2B VWD hoặc bệnh giả VWD

Ngưng tập với ristocetin liều thấp.