Áp dụng Ribozym và RNAi trong điều trị ung thư (P1)

MỞ ĐẦU

Ribozym là các phân tử acid ribonucleic (RNA) có khả năng tác động như các enzym ngay cả khi vắng mặt hoàn toàn các protein. Chúng có hoạt tính xúc tác bẻ gẫy và /hoặc hình thành các liên kết cộng hóa trị với tính đặc hiệu và gia tăng tốc độ các phản ứng một cách phi thường. Khả năng của RNA với tư cách một chất xúc tác lần đầu tiên được phát hiện trong tự ghép nối intron nhóm I của Tetrahymena với bán phần RNA của RNase P. Tiếp sau sự phát hiện 2 enzym RNA này là sự xúc tác qua trung gian RNA liên quan tới sự tự ghép nối các intron nhóm II của nấm men, nấm, và ty thể thực vật (cũng như lục lạp); các RNA virusoid và viroid thực vật chuỗi đơn; virus viêm gan delta; và RNA vệ tinh từ ty thể Neurospora. Khá rõ ràng là cấu thành RNA tiểu đơn vị lớn của ribosome có chức năng như là một peptidyltransferase. Với chức năng tiềm tàng thực thi các ghép nối nhân nhỏ hơn (spicesomal smaller nuclear snRNA) như ribozym nó lại liên hợp với tiền RNA thông tin (pre-mRNA) để xúc tác cho sự ghép nối pre -RNA. Cũng rất giống với motif xúc tác RNA bổ sung, những vai trò mới của xúc tác qua trung gian RNA cũng được phát hiện càng nhiều khi đi sâu tìm hiểu hệ gen của các cơ thể khác nhau. Ribozym cũng có thể là một hợp chất tự nhiên hay được tổng hợp nhân tạo để nhắm vào các trình tự đặc hiệu cis- hoặc trans-. Phạm vi các hoạt động hóa sinh in vitro nhằm lựa chọn các protocol cũng chưa được phát triển. Các ribozym có thể thao tác một cách dễ dàng để tác động lên các cơ chất mới. Các RNA được thiết kế theo đơn đặt hàng có tiềm năng lớn với tư cách là các tác nhân trị liệu và đang trở thành một công cụ mạnh đối với các nhà sinh học phân tử. Các ribozym xúc tác đầu búa (hammerhead) và cặp tóc (hairpin) là đại diện cho các lựa chọn phổ thông áp dụng trong trị liệu được mô tả trên Hình 5.1.

Hình 5.1. Các ribozym xúc tác hay được dùng nhất là dạng đầu búa và dạng cặp tóc. Trên hình vẽ là cấu trúc bậc hai của ribozym hình đầu búa. Trong đó: N = nucleotid bất kỳ, R = purin, Y = pyrimidin. Sơ đồ cấu trúc bậc 3 của ribozym hình đầu búa cũng được vẽ cạnh mô hình cấu trúc bậc 2 của nó. Các bộ phận (stem) tương ứng I, II và III ở cả 2 cấu trúc cũng được thể hiện. Trong ribozym hình đầu búa thì H =A, C hoặc U ở vị trí phân cắt. Trong ribozym hình cặp tóc thì H1, H2 là những vùng xoắn của cấu trúc RNA. (Theo Lisa Scherer và John J. Rossi. (2005) Cancer Gene Therapy. Human Press. Totowwa, New Jersey)

Sự gây nhiễu của RNA (RNA interference)

Sự gây nhiễu RNA (RNAi) là một cơ chế làm yên lặng gen được sáng tỏ một cách cội nguồn ở thực vật, cũng như là sự yên lặng gen sau phiên mã ở Caenorhabditis elegans và ruồi giấm Drosophila. Trong mô hình đương thời, con đường RNAi được hoạt hóa bởi một súng RNA sợi đôi (double-stranded RNA dsRNA), sau đó nó được xử lý thành những đoạn dsRNA ngắn từ 21 đến 22 nt được ám chỉ như là các RNA gây nhiễu nhỏ (small interfering RNA –siRNA) bởi một enzym tế bào có tên là Dicer (Hình 5.2A). Các siRNA sẽ hợp nhất thành phức hợp yên lặng cảm ứng RNA (RNA-induced silencing complex RISC), trong đó siRNA hoạt động với tư cách là kẻ dẫn đường nhận dạng mRNA để tiêu hủy. Trong các TB động vật có vú thì dsRNA dài hơn 30 nt sẽ làm bùng phát con đường interferon để hoạt hóa PKR và 2-5 - oligoadenylat synthase hơn là con đường RNAi. Tuy nhiên, các siRNA ngắn hơn được cài ngoại sinh vào các TB động vật có vú trong phiên mã nội sinh qua bước Dicer lại hoạt hóa trực tiếp sự thoái hóa mRNA tương đồng mà không cần khởi động đáp ứng interferon (Hình 5.2B).

Hình 5.2. Cơ chế mRNA đích thoái hóa được hướng bởi siRNA trong các tế bào động vật có vú. (A) các dsRNA dài hơn 30bp được phân cắt bởi một thành viên họ RNase III tên là Dicer thành các siRNA 21-23-nt có 2 base 3 chồi ra. Các siRNA không bị tổn thương bởi phức helicase thì vẫn còn đặc tính và sợi antisense được cặp đôi bởi một phức hợp có tên là phức hợp yên lặng cảm ứng RNA (RNA-induced silencing complex RISC). RISC đảm trách phân cắt đặc hiệu vị trí RNA đích và tái chế. (B) siRNA đơn tổng hợp hoặc hỗn hợp của siRNA enzym gốc đi từ RNA đích có thể ghép nối một cách ngoại sinh. Có thể lựa chọn cách tạo ra SiRNA nội sinh bằng việc sử dụng hệ thống hộp kép trong đó siRNA được phiên mã như một vòng cặp tóc. Chưa rõ là vòng shRNA đã được xử lý như thế nào. (Theo Lisa Scherer và John J. Rossi. (2005) Cancer Gene Therapy. Human Press. Totowwa, New Jersey).

ỨNG DỤNG CỦA RIBOZYM

Các ribozym được ứng dụng như các tác nhân kháng virus, dùng để điều trị ung thư và các rối loạn di truyền và cũng là công cụ để làm sáng tỏ các con đường và phê chuẩn đích. Khởi đầu sử dụng ribozym là nhằm vào kháng virus, chủ yếu là điều trị virus gây thiếu hụt miễn dịch trên người (HIV). Các virus mà có thể tác động thông qua sản phẩm trung gian RNA hệ gen trong chu kỳ tái bản của chúng như HIV, virus gây viêm gan B, C đó là những đích hấp dẫn bởi vì các mẫu đơn ribozym có thể nhắm tới RNA hệ gen virus và cả các mRNA. Ribozym cũng được sử dụng rộng rãi đối với các gen tế bào đích bao hàm cả những gen biểu hiện một cách lầm lạc trong ung thư.

Đích ribozym đầu tiên là bản sao tổng hợp bcr-abl được kiến tạo từ nhiễm sắc thể Philadelphia liên quan tới bệnh bạch cầu dòng tuỷ mạn tính. Đặc trưng của nhiễm sắc thể này là bằng sự chuyển vị (translation) đã biểu hiện được protein tổng hợp bcrabl tải nạp. Trong trường hợp này, ribozym được thiết kế để nhắm vào mRNA tổng hợp một cách đặc hiệu chứ không phải là nhắm vào bcr hay abl bình thường để ngăn chặn chức năng của gen gây ung thư bcr-abl. Khi đột biến ở codon 12 trong c-H-ras từ GGU thành GUU thì tạo nên một vị trí cho sự phân cắt qua trung gian ribozym đầu búa. Một ribozym biểu hiện nội sinh nhắm vào đích này đã có hiệu ứng ngăn ngừa sự hình thành tiêu điểm (focus formation) với khoảng 50% tế bào NIH3T3 đã được thâm nhiễm với gen ras hoạt hóa. Trái lại, các tế bào biểu hiện ribozym tương tự này nhưng lại thâm nhiễm với ras hoạt hóa trong đó có sự thay đổi codon ở vị trí 61 thay vì vị trí 12 thì không ngăn ngừa được sự hình thành tiêu điểm. Các ribozym nhắm vào HER2/neu được biểu hiện quá mức trong ung thư vú đã làm giảm đáng kể sự tạo u của các tế bào này trên chuột.

Hơn nữa, để nhắm trực tiếp vào các gen gây ung thư, các ribozym cũng được áp dụng một cách gián tiếp hơn với tư cách là các trị liệu kháng ung thư. Chẳng hạn như các riobozyme nhắm vào các gen kháng đa thuốc 1 (multiple drug resistance gene 1) hoặc fos mRNA trong các dòng tế bào ung thư đã tạo được các TB nhạy cảm hơn với các tác nhân hóa trị liệu. Mặt khác, ribozym nhắm vào bcl-2 đã làm bùng phát apoptosis trong các TB ung thư vùng miệng.

Các yếu tố đòi hỏi cho sự di căn cũng là đích hấp dẫn cho ribozym. Các ribozym nhắm mục tiêu chống lại CAPL/mts, metalloprotein gian bào (matrix), pleiotrophin và VLA-6 integrin đều làm giảm tiềm năng di căn của các TB khối u cần lưu tâm. Sự tạo mạch cũng là đích quan trọng cho gen trị liệu ung thư và quá trình này đã được ngăn chặn ở chuột bởi ribozym đích vào protein gắn yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi và pleiotrophin.

Các trị liệu với cơ sở ribozym đã được test ở động vật nhằm ức chế các rối loạn tăng sinh khác như tái hẹp động mạch vành. Antitelomerase RNA ribozym cũng được test để áp dụng trong gen trị liệu ung thư. Dĩ nhiên việc sử dụng ribozym như các tác nhân trị liệu cần có sự thay đổi phù hợp với từng loại ung thư.

Sự chuyển giao

Bất kỳ dạng ribozym nào định lựa chọn thì cũng phải đưa được vào các TB đích. Có 2 cơ chế chung về việc đưa các phân tử RNA xúc tác vào trong các TB - đó là chuyển giao ngoại sinh các ribozym hình thành trước (preformed ribozym) và biểu hiện nội sinh từ một đơn vị phiên mã. Ribozym hình thành trước có thể được chuyển vào trong các TB nhờ các phương thức: liposome, điện xung (electroporation) hoặc vi tiêm.

Rất nhiều phương pháp lý thú trong tổng hợp hóa học RNA và các dạng cải biến của RNA đã được thực hiện trong vài năm qua. Các phân tử có tính ổn định lâu dài trong huyết thanh hoặc trong các môi trường nội bào đã được tổng hợp. Một số ribozym với bộ khung cải biến vẫn duy trì được tính đặc hiệu vị trí và những đặc tính xúc tác của các RNA chưa cải biến, và một số lại làm tăng đặc tính xúc tác vì thế chúng trở thành các ứng cử viên cho sự chuyển giao ex vivo. Các ribozym cải biến hóa học thể hiện khả năng chuyển giao không cần capsul hóa mà vẫn vào được tế bào.

Biểu hiện nội bào ổn định các ribozym hoạt hóa phiên mã có thể thực hiện được nhờ chuyển giao qua trung gian vec tơ virus. Hiện nay, các vec tơ retrovirus thường hay được sử dụng nhất đối với tế bào nuôi cấy, các TB sơ cấp (gốc) và các TB động vật chuyển gen. Các vec tơ retrovirus có lợi thế là hợp nhất ổn định vào trong hệ gen TB chủ đang phân chia và tất nhiên là khi vắng mặt bất kỳ gen virus nào được biểu hiện cũng làm giảm ngẫu nhiên đáp ứng miễn dịch ở động vật. Hơn nữa, các retrovirus có thể tạo nên các dạng giả một cách dễ dàng với nhiều protein vỏ để nới rộng hoặc hạn chế tính hướng tế bào chủ vì thế mà tăng thêm mức độ đích TB cho sự chuyển gen ribozym. Các vec tơ adenovirus có thể được tạo ra ở các độ chuẩn cao và tải nạp rất hiệu quả nhưng nó lại không hợp nhất vào hệ gen vật chủ; vậy là sự biểu hiện của gen chuyển chỉ là tức thời trong các TB đang phân chia tích cực. Các hệ thống chuyển giao virus khác là virus adeno liên hợp, virus alpha và lentivirus. Virus adeno liên hợp được hấp dẫn bởi vì nó là virus nhỏ, không gây bệnh và có thể hợp nhất một cách ổn định vào trong hệ gen vật chủ. Với hệ virus alpha, khi sử dụng virus Semliki Forest tái tổ hợp đã cho hiệu ứng tải nạp cao đối với các TB động vật có vú biểu hiện ribozym tế bào chất.

Phương tiện vận chuyển khác cho sự chuyển giao ex vovo gen ribozym là cationic lipid. Vì có nhiều công thức lipid nên tốt nhất là chọn các lipid cho hiệu ứng cao nhất đối với sự chuyển gen mà độc tính lại ít nhất.

ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN BIỂU HIỆN RIBOZYM

Việc trị liệu và các nghiên cứu xác nhận đích chắc phải được thử nghiệm trên động vật. Các ribozym đã được sử dụng trong chuột chuyển gen nhằm kiến tạo các mô hình bệnh như đái tháo đường bằng việc điều hòa xuống một cách chọn lọc hexokinase mRNA trong các tiểu đảo của tụy. Trong trường hợp này, sự biểu hiện ribozym được kiểm soát bởi promoter insulin vì thế nó chỉ biểu hiện ở các tế bào của tụy. Sự chuyển giao ribozym bằng retrovirus để kháng lại neuregulin 1 ở phôi gà cũng ngang bằng với kiểu hình (phenotype) gây tổn hại phôi với tư cách là một gen knockout. Khi định vị được sự chuyển giao bằng retrovirus với một ribozym tương tự thì sau đó có thể phân tích được một cách kỹ lưỡng con đường hóa sinh của neuregulin. Dùng ribozym cảm ứng nhiệt kháng fushi tarzu ở ruồi giấm sẽ làm gián đoạn đúng lúc sự tiến triển chức năng này ở phôi ruồi giấm.

SỬA CHỮA RNA QUA TRUNG GIAN RIBOZYM

Một áp dụng trị liệu mới của các ribozym là khai thác hoạt tính ghép nối trans của ribozym Tetrahymena. Ribozym được sử dụng để sửa chữa mRNA khiếm khuyết một trình tự chức năng gây bởi sự ghép nối trans trên các RNA này. Những ribozym này được thiết kế để liên kết và phân cắt các RNA 5’ đích của đột biến không mong muốn. Vì ribozym trong trường hợp này là một intron nên nó được công nghệ hóa để thực hiện việc chỉnh sửa trình tự RNA với tư cách là 3exon. Tiếp sau sự phân cắt RNA đích đột biến là ribozym xúc tác gắn trình tự hoang dã vào bản sao đã phân cắt. Đây là minh chứng đầu tiên về sự hiệu chỉnh của bản sao Lax Z đột biến ở vi khuẩn và sau đó là hiệu chỉnh thông tin tế bào liềm trong các tế bào dòng hồng cầu.

SỰ TIẾN HÓA CỦA RIBOZYM

Việc phát hiện ra ribozym đã làm bùng phát tranh cãi mới về giả thuyết “thế giới RNA” (RNA world), theo đó thì tất cả các quá trình sinh hóa đều được thực hiện bởi enzym có nền tảng RNA. Kể từ đó, sự tiến hóa RNA bắt buộc phải đi từ in vitro để tiến gần tới những enzym RNA có khả năng thực hiện đa dạng rộng các phản ứng hoá sinh như hình thành liên kết carbon -carbon và liên kết peptide. Tiến hóa RNA in vitro được sử dụng để kiến tạo các ribozym phân cắt RNA với các domain nhỏ hơn, các ribozym phân cắt DNA và các motif xúc tác mới. Ngay cả enzym DNA phân cắt RNA cũng được tạo ra thông qua tiến hóa (những thay đổi) in vitro. Những enzym tiến hóa (evolved) này là ví dụ điển hình về sức mạnh của tiến hóa in vitro.

Cũng có lý để kết luận rằng việc đạt được các tương tác cơ chất - enzym hiệu ứng và chức năng ribozym trong môi trường gian bào không phải là một công việc dễ dàng và các chiến lược mới cho sự biểu hiện và định vị ribozym trong các môi trường gian bào là một nhu cầu đòi hỏi để cho phép sử dụng một cách phổ biến các ribozym như các tác nhân trị liệu.

NHỮNG CÂN NHẮC KHÁC

Mặc dầu tính đặc hiệu về sự cặp đôi base đã tạo dựng được đích chọn lọc, làm tối thiểu hóa các độc tính tiềm ẩn nói chung. Nhưng vấn đề độc tính thì vẫn phải làm test một cách nghiêm khắc bởi vì khi các ribozym làm mất sự cặp đôi đối với một cơ chất không phải là đích có thể sẽ tạo ra hiệu ứng ức chế antisense không mong muốn. Vì bất kỳ một trình tự ribozym nào cũng có các tương tác cặp đôi base tiềm tàng khác nhau, vì thế việc tích lũy các số liệu từ các thí nghiệm về ribozym khác nhau là cần thiết cho việc đánh giá sự tiềm ẩn này một cách nghiêm khắc. Một số tiềm ẩn về độc tính là sự tương tác không đặc hiệu của ribozym với các protein của tế bào hay việc phát sinh sự tập trung cao tại gian bào các sản phẩm phân cắt và hiệu ứng ức chế sự chuyển hóa tế bào do các cải biến hóa học khi tiền tổng hợp ribozym.

Một trong số các lợi thế tiềm tàng của ribozym so với các RNA antisense là hoạt tính xúc tác của chúng mà về lý thuyết có thể dẫn đến làm bất hoạt nhiều cơ chất đích. Tuy nhiên, cũng cần phải chứng minh liệu hoạt tính xúc tácònày có xảy ra ở gian bào không? Có lẽ là sự luân chuyển cơ chất qua trung gian ribozym gian bào đã tạo thuận lợi cho sự phân cắt qua trung gian ribozym đầu búa. Các thí nghiệm được thiết kế để phát hiện các protein tạo thuận lợi cho sự luân chuyển ribozym gian bào hiện nay mới chỉ được thực hiện ở một vài phòng thí nghiệm. Việc làm giầu sự liên hợp ribozym - protein cùng với nâng cao hoạt tính xúc tác cũng đã được thăm d trong các chiến lược khám phá in vitro. Sau chót là việc thiết kế mẫu và tổng hợp hóa học các ribozym nhằm tạo khả năng luân chuyển xúc tác cao bởi các base đặc hiệu và những cải biến bộ khung cũng cần được thực hiện.

Xem tiếp: Áp dụng Ribozym và RNAi trong điều trị ung thư (P2)

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

facebook.com/BVNTP