Kỹ thuật lai tại chỗ có gắn chất màu (CISH)

NGUYÊN TẮC

Xét nghiệm lai tại chỗ sử dụng mồi dò DNA gắn digoxigenin gắn chất mầu diaminobenzidin (DAB) nhằm xác định tình trạng khuyếch đại gen Her-2/neu.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 01

Cử nhân sinh học (không bắt buộc): 01

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện

Máy lai biến tính
Kính hiển vi quang học
Phiến kính, lá kính
Máy cắt lát mỏng
Lưỡi dao cắt lát mỏng
Tủ ấm 37^o và 56^o
Tủ lạnh
Ống hút

Hóa chất

Ezprep khử parafin
Dung dịch CC2 khử parafin
Protease
Nước bạc
Dung dịch SIL ISH DNP CHRC
RED ISH DIG FR
RED ISH DIG FR
Thuốc nhuộm hematoxylin
Dung dịch Bluing
Bộ kít Her-2 và CEP17
Cồn (70^o, 80^o, 85^o, 90^o, 100^o).
Xylen
Dung dịch rửa

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Mẫu mô được cắt mỏng 4 micromet, gắn lên phiến kính đã được tráng silan

Cài đặt chương trình cho máy

Dán nhãn và đặt phiến kính gắn mẫu mô đã cắt vào máy

Khử parafin bằng EZprep

Bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC2: 30 phút ở 90^oC

Xử lý protease: 16 phút

Ủ mảnh cắt với 100 µl probe Her-2 và CEP17 trong 4 phút

Biến tính DNA trong 20 phút ở 80^oC

Lai DNA trong 6 giờ ở 37^oC

Rửa bằng nước bạc trong 8 phút ở 72^oC

Ủ trong dung dịch SIL ISH DNP CHRC: 4 phút

Ủ với RED ISH DIG FR: 24 phút

Ủ với RED ISH DIG FR: 8 phút

Nhuộm hematoxylin II trong 4 phút

Nhuộm với dung dịch Bluing trong 4 phút

Lấy mảnh cắt ra khỏi máy và làm sạch mảnh cắt

Làm khô mảnh cắt trong 1 giờ ở 60^oC

Ngâm mảnh cắt trong xylen 3 phút x 2 lần

Gắn lá kính và đọc kết quả.

KẾT QUẢ

Đánh giá tỷ lệ Her-2/CEP17 bằng cách đếm tín hiệu Her-2 (màu đỏ) và tín hiệu NST17 (màu nâu vàng) trong 20 nhân tế bào ung thư xâm nhập.

Tỷ lệ Her-2/CEP17 < 1,8: không khuyếch đại
Tỷ lệ Her-2/CEP17 ≥ 2,2: có khuyếch đại
Tỷ lệ 2,5 < Her-2/CEP17 ≤ 5: khuyếch đại thấp
Tỷ lệ Her-2/CEP17 > 5: khuyếch đại cao
Tỷ lệ 1,8 ≤ Her-2/CEP17 < 2,2: khuyếch đại giáp biên, cần đếm lại hoặc đếm thêm trên 20 nhân tế bào u xâm nhập nữa.

Số lượng tín hiệu màu đỏ sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội và đa bội.

NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

KHÔNG CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN HIỆU YẾU
NGUYÊN NHÂN	CÁCH KHẮC PHỤC
Khử parafin không hết	Tăng thời gian khử parafin hoặc thay thế EZREP mới
Điều kiện lai không chính xác	Kiểm tra lại nhiệt độ máy lai hoặc buồng lai
Nhiệt độ rửa sau khi lai không chính xác	Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa hoặc tăng thời gian lai
Có bóng khí khi gắn lá kính	Loại bỏ bóng khí trước khi đưa vào máy lai
Không đủ dung dịch lai hoặc probe	Tăng thêm lượng probe
Digest không đủ	Kiểm tra lại nhiệt độ digest hoặc tăng thêm thời gian digest
Thời gian cố định quá dài	Kiểm tra lại quy trình cố định bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định ngay sau mổ trong 6 – 48 giờ, hoặc có thể giảm bớt thời gian bộc lộ
TÍN HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM
NGUYÊN NHÂN	CÁCH KHẮC PHỤC
Tồn tại nhiều vùng khác nhau trên bệnh phẩm	-Tăng thêm thời gian cố định
Probe phân bố không đều trên bệnh phẩm do có bọt khí	-Thực hiện lại quá trình lai và đảm bảo không có bọt khí
Kích thước bệnh phẩm quá lớn	-Tăng thể tích dung dịch lai
NHUỘM NỀN CAO (HIGH GROUND)
NGUYÊN NHÂN	CÁCH KHẮC PHỤC
Do quá trình rửa sau khi lai	Kiểm tra lại pH của dung dịch rửa (7,2-7,5) Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa Lắc trong quá trình rửa Tăng thời gian rửa bằng SSC lên 5 phút Tăng thời gian rửa nghiêm ngặt sau lai Điều chỉnh thời gian nhuộm bằng H&E và Bluing
MẤT HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM
NGUYÊN NHÂN	CÁCH KHẮC PHỤC
Sấy tiêu bản không đúng	-Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy (56^oC)
Bộc lộ quá mức	Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ Giảm thời gian bộc lộ Giảm thời gian digest
Biến tính quá mức	Kiểm tra lại nhiệt độ biến tính Giảm thời gian biến tính
Bệnh phẩm bị bong ra khi loại bỏ lá kính sau khi lai	-Loại lá kính bằng cách ngâm tiêu bản sau lai vào dung dịch rửa và lắc đều