✴️ Kỹ thuật lai tại chỗ có gắn chất màu (CISH)

Nội dung

NGUYÊN TẮC

Xét nghiệm lai tại chỗ sử dụng mồi dò DNA gắn digoxigenin gắn chất mầu diaminobenzidin (DAB) nhằm xác định tình trạng khuyếch đại gen Her-2/neu.

 

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Bác sĩ giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học:                 01

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học:      01

Cử nhân sinh học (không bắt buộc):                       01

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện

  • Máy lai biến tính
  • Kính hiển vi quang học
  • Phiến kính, lá kính
  • Máy cắt lát mỏng
  • Lưỡi dao cắt lát mỏng
  • Tủ ấm 37o và 56o
  • Tủ lạnh
  • Ống hút

Hóa chất

  • Ezprep khử parafin
  • Dung dịch CC2 khử parafin
  • Protease
  • Nước bạc
  • Dung dịch SIL ISH DNP CHRC
  • RED ISH DIG FR
  • RED ISH DIG FR
  • Thuốc nhuộm hematoxylin
  • Dung dịch Bluing
  • Bộ kít Her-2 và CEP17
  • Cồn (70o, 80o, 85o, 90o, 100o).
  • Xylen
  • Dung dịch rửa

 

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Mẫu mô được cắt mỏng 4 micromet, gắn lên phiến kính đã được tráng silan

Cài đặt chương trình cho máy

Dán nhãn và đặt phiến kính gắn mẫu mô đã cắt vào máy

Khử parafin bằng EZprep

Bộc lộ kháng nguyên bằng dung dịch CC2: 30 phút ở 90oC

Xử lý protease: 16 phút

Ủ mảnh cắt với 100 µl probe Her-2 và CEP17 trong 4 phút

Biến tính DNA trong 20 phút ở 80oC

Lai DNA trong 6 giờ ở 37oC

Rửa bằng nước bạc trong 8 phút ở 72oC

Ủ trong dung dịch SIL ISH DNP CHRC: 4 phút

Ủ với RED ISH DIG FR: 24 phút

Ủ với RED ISH DIG FR: 8 phút

Nhuộm hematoxylin II trong 4 phút

Nhuộm với dung dịch Bluing trong 4 phút

Lấy mảnh cắt ra khỏi máy và làm sạch mảnh cắt

Làm khô mảnh cắt trong 1 giờ ở 60oC

Ngâm mảnh cắt trong xylen 3 phút x 2 lần

Gắn lá kính và đọc kết quả.

 

KẾT QUẢ

Đánh giá tỷ lệ Her-2/CEP17 bằng cách đếm tín hiệu Her-2 (màu đỏ) và tín hiệu NST17 (màu nâu vàng) trong 20 nhân tế bào ung thư xâm nhập.

  • Tỷ lệ Her-2/CEP17 < 1,8: không khuyếch đại
  • Tỷ lệ Her-2/CEP17 ≥ 2,2: có khuyếch đại
  • Tỷ lệ 2,5 < Her-2/CEP17 ≤ 5: khuyếch đại thấp
  • Tỷ lệ Her-2/CEP17 > 5: khuyếch đại cao
  • Tỷ lệ 1,8 ≤ Her-2/CEP17 < 2,2: khuyếch đại giáp biên, cần đếm lại hoặc đếm thêm trên 20 nhân tế bào u xâm nhập nữa.

Số lượng tín hiệu màu đỏ sẽ xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng là 1, 2 và 3 hoặc nhiều hơn tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội và đa bội.

 

NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

KHÔNG CÓ TÍN HIỆU HOẶC TÍN HIỆU YẾU

NGUYÊN NHÂN

CÁCH KHẮC PHỤC

Khử parafin không hết

Tăng thời gian khử parafin hoặc thay thế EZREP mới

Điều kiện lai không chính xác

Kiểm tra lại nhiệt độ máy lai hoặc buồng lai

Nhiệt độ rửa sau khi lai không chính xác

Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa hoặc tăng thời gian lai

Có bóng khí khi gắn lá kính

Loại bỏ bóng khí trước khi đưa vào máy lai

Không đủ dung dịch lai hoặc probe

Tăng thêm lượng probe

Digest không đủ

Kiểm tra lại nhiệt độ digest hoặc tăng thêm thời gian digest

Thời gian cố định quá dài

Kiểm tra lại quy trình cố định bệnh phẩm, bệnh phẩm cần được cố định ngay sau mổ trong 6 – 48 giờ, hoặc có thể giảm bớt thời gian bộc lộ

TÍN HIỆU KHÔNG ĐỒNG ĐỀU GIỮA CÁC VÙNG TRÊN BỆNH PHẨM

NGUYÊN NHÂN

CÁCH KHẮC PHỤC

Tồn tại nhiều vùng khác nhau trên bệnh phẩm

-Tăng thêm thời gian cố định

Probe phân bố không đều trên bệnh phẩm do có bọt khí

-Thực hiện lại quá trình lai và đảm bảo không có bọt khí

Kích thước bệnh phẩm quá lớn

-Tăng thể tích dung dịch lai

NHUỘM NỀN CAO (HIGH GROUND)

NGUYÊN NHÂN

CÁCH KHẮC PHỤC

Do quá trình rửa sau khi lai

Kiểm tra lại pH của dung dịch rửa (7,2-7,5)

Kiểm tra lại nhiệt độ buồng rửa

Lắc trong quá trình rửa

Tăng thời gian rửa bằng SSC lên 5 phút

Tăng thời gian rửa nghiêm ngặt sau lai

Điều chỉnh thời gian nhuộm bằng H&E và Bluing

MẤT HAY TIÊU BIẾN BỆNH PHẨM

NGUYÊN NHÂN

CÁCH KHẮC PHỤC

Sấy tiêu bản không đúng

-Kiểm tra lại nhiệt độ tủ sấy (56oC)

Bộc lộ quá mức

Kiểm tra lại nhiệt độ bộc lộ

Giảm thời gian bộc lộ

Giảm thời gian digest

Biến tính quá mức

Kiểm tra lại nhiệt độ biến tính

Giảm thời gian biến tính

Bệnh phẩm bị bong ra khi loại bỏ lá kính sau khi lai

-Loại lá kính bằng cách ngâm tiêu bản sau lai vào dung dịch rửa và lắc đều

 

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

  facebook.com/BVNTP

  youtube.com/bvntp

Chia sẻ trên Zalo
return to top