Phương pháp nhuộm Hematoxylin & Eosin (H&E)

Tại sao lại thực hiện nhuộm Hematoxylin – Eosin

Xét nghiệm mô bệnh học và tế bào học là nền tảng vô cùng quan trọng trong chẩn đoán, được đánh giá là tiêu chuẩn vàng để xác định bệnh. Hầu hết các chẩn đoán mô bệnh học đều cần phải dựa vào kỹ thuật nhuộm Hematoxylin – Eosin (H&E). Với đặc tính bắt màu tương phản đặc trưng cho các cấu trúc mô học, tế bào, giúp nhà giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học biết được đặc điểm chi tiết tế bào mà còn thấy được cấu trúc của mô do các tế bào tạo ra cũng như mối tương quan giữa mô đệm và mô chủ, đặc biệt, trong mô ung thư.

Vậy phương pháp Hematoxylin – Eosin là gì?

Hematoxylin – Eosin (H&E) là phương pháp nhuộm mô học thường quy phổ biến nhất hiện nay. Định nghĩa một cách đơn giản, H&E là phương pháp nhuộm hai màu liên tiếp, hematoxylin có khả năng nhuộm các thành phần về nhân tế bào, trong khi eosin nhuộm các thành phần của bào tương.

Hematoxylin: là màu nhuộm có nguồn gốc từ thiên nhiên, được chiết xuất từ lõi thân cây Hematoxylon Campechianum (Hình 1). Được sử dụng trong phương pháp nhuộm vi thể từ những năm 1840. Ở dạng thô, Hematoxylin không có tác dụng nhuộm màu. Tuy nhiên khi được oxy hóa Hematoxylin (C₆H₁₄O₆) bị mất 2 nguyên tử Hydrogen trở thành chất hoạt hóa Hematein (C₆H₁₂O₆) có khả năng bắt màu nhân tế bào.

Eosin: là muối Sodium (Natri) của acid màu (Hình 2). Có 2 loại Eosin là Eosin Y và Eosin B, trong dó Eosin Y được sử dụng rộng rãi và phổ biến hơn. pH ảnh hưởng quan trong đến khả năng phân ly và bắt màu của phẩm nhuộm Eosin trên lát cắt mô học. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh, Eosin bắt màu tốt và đạt tối ưu với các thành phần Protein ở pH 4.6-5. Với pH>7 cả Eosin và màng bào tương Protein cùng điện tích âm (-) à không bắt màu.

nhuộm eosin

Nguyên tắc:

Cơ chế bắt màu của Hematoxylin với nhân tế bào vẫn chưa được hiểu rõ. Tuy nhiên cơ chế được ủng hộ nhiều nhất là cơ chế lực hút của hai điện tích trái dấu (Bancroft’s Theory and Practice 7^th edition). Phức hợp chất gắn màu và Hematoxylin sau khi bị oxy hóa mất 2 nguyên tử Hydrogen tạo thành anion Hematein mang điện tích âm (-) có ái lực mạnh đối với các thành phần cation mang điện tích dương (+) ở nhiễm sắc chất trong nhân.Tùy thuộc và thành phần chất gắn màu có trong thuốc nhuộm mà nhân tế bào có dải màu từ xanh đến tím.
Eosin bắt màu bằng lực hút tĩnh điện giữa Eosin và các thành phần của bào tương cho ra dải màu từ hồng đến đỏ.

Quy trình nhuộm:

H&E là phương pháp nhuộm hai màu liên tiếp. Ở bài viết này chúng tôi trình bày phương pháp nhuộm nhân theo nguyên tắc tăng dần, nhuộm bào tương theo nguyên tắc giảm dần. (Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành giải phẫu bệnh, tế bào học - Bộ Y tế)

Tiến hành:

Bước 1: Tẩy parafin trong 3 bể xylen, mỗi bể 5 phút.
Bước 2: Qua 4 bể cồn: 100º - 95º - 80º - 70º, mỗi bể nhúng 15 lần.
Bước 3: Rửa nước cất: nhúng 15 lần.
Bước 4: Nhuộm nhân bằng Hematoxylin Harris: 3-5 phút hoặc lâu hơn.
Bước 5: Rửa nước chảy: 5-10 phút.
Bước 6: Kiểm tra màu của nhân qua kính hiển vi, nếu đậm, tẩy nhẹ bằng cồn-acid.
Bước 7: Rửa nước chảy: 1 phút.
Bước 8: Nhuộm Eosin1%: 1 -2 phút.
Bước 9: Rửa nước chảy: 1 phút.
Bước 10: Biệt hoá trong 2 bể cồn 95º - 100º, mỗi bể 15 lần nhúng.
Bước 11: Qua 3 bể xylen, bể I và II nhúng 15 lần, bể III: 5-10 phút.
Bước 12: Gắn lá kính.

Kết quả:

Nhân tế bào: xanh /đen
Tế bào chất: màu hồng với nhiều sắc độ khác nhau.
Sợi cơ: hồng đậm/ đỏ
Tế bào máu: cam/đỏ
Fibrin: hồng đậm

nhuộm HE

Một số vấn đề thường gặp và hướng xử lý:

Bào tương và nhân đều bắt màu nhạt: thuốc nhuộm cũ à thay thuốc nhuộm mới.
Nhân nhạt màu: tăng thời gian nhuộm nhân.
Nhân đậm màu quá mức: tẩy nhẹ bằng cồn-acid.
Tiêu bản đầy cặn: Lọc thuốc nhuộm trước khi sử dụng.

Tổng kết

Nhuộm Hematoxylin và Eosin (H&E) là phương pháp nhuộm chẩn đoán cơ bản trong thực hành giải phẫu bệnh. Phương pháp nhuộm H&E cho phép đánh giá mối liên quan tổng thể giữa các tế bào, những thành phẩn cấu trúc cơ bản của biểu mô, mô liên kết, thần kinh và mô cơ. Việc nhận biết được những tác động của các hoạt động phẫu tích bệnh phẩm, cố định và chuyển đúc lên kết quả nhộm H&E là rất quan trọng.

Nếu chúng ta kiểm soát được những yếu tố có thể tác động lên quá trình nhuộm một cách khoa học và cẩn thận thì có thể loại bỏ được nhiều vấn đề.

TÀI LIỆU THAM KHẢO: