PHẦN 1: GIỚI THIỆU
Trẻ sơ sinh có mức VWF tăng lúc sinh và đạt mức bình thường lúc 6 tháng tuổi.
VWF tăng theo độ tuổi với tỷ lệ khoảng 10IU/dl mỗi thập kỷ.
VWF thay đổi theo nhóm máu – nhóm máu O có mức thấp hơn các nhóm khác. Điều này quan trọng trong chẩn VWD khi mức VWF nằm ở giới hạn dưới và bệnh nhân có nhóm máu O.
Tiền sử chảy máu là cơ bản để chẩn đoán VWD – sử dụng thang điểm chảy máu quy ước được khuyến cáo.
Nhớ rằng Ristocetin gây kết dính hơn là gây ngưng tập tiểu cầu. Sự ngưng tập phụ thuộc vào việc gắn fibrinogen vào phức hợp GpIIb/IIIa.
VWD type 1C (Type 1 Vicenza) là một dưới nhóm của VWD do đột biến gây rút ngắn thời gian bán hủy của phân tử VWF.
VWD type 2A nay được chia làm 2 nhóm nhỏ: 2A1 do bất thường tổng hợp VWD và 2A2 do tăng ly giải protein bởi ADAMTS13.
GIỚI THIỆU
VWF là một glycoprotein kích thước lên tới 20 x 106 Da. Nó được tổng hợp bởi:
- Tế bào nội mạc mạch máu, nơi nó được lưu giữ trong thể Weibel-Palade trước khi được bài xuất 2. Mẫu tiểu cầu của tủy xương và nó cũng hiện diện ở tiểu cầu.
- VWF ban đầu được tổng hợp như một chuỗi multimer rất lớn, sau đó được thoái giáng bởi ADAMTS13. Một sự suy giảm ADAMTS13 dẫn đến tích tụ multimer trọng lượng phân tử cao và gây ra đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của bệnh lý xuất huyết giảm tiểu cầu huyết khối (TTP). Xét nghiệm yếu tố ADAMTS13 cũng được viết ở bài riêng.
VWF có 2 vai trò cơ bản:
- Là một chất mang của FVIII, đảm bảo nó không bị thoái giáng trong huyết tương
- Là một protein kết dính liên quan đến sự tương tác giữa tiểu cầu và thành mạch Gene mã hóa VWF dài 172kb, gồm 52 exon, ở NST số 12 (12p13.3), mã hóa một protein có 2813 amino acid(aa) bao gồm 3 phần: một peptide tín hiệu (signal peptide) 22 aa, một prepropeptide 741 aa (từ 23-763), một protein trưởng thành 2050 aa (từ 764-2800). Protein trưởng thành chia ra một loạt các domain chứa những vùng chức năng khác nhau. VWF trưởng thành trong huyết tương có thời gian bán hủy khoảng 12 giờ. (9-15 giờ)
Có một giả gene (pseudogene) của một phần yếu tố von Willebrand chưa được xử lý nằm ở NST 22.
TÓM TẮT NHỮNG KÝ HIỆU LIÊN QUAN ĐẾN YẾU TỐ VON WILLBRAND
CHẨN ĐOÁN BỆNH VON WILLEBRAND
VWD được phân thành 3 type từ 1 đến 3.
|
Đánh giá |
Diễn giải |
|
|
Triệu chứng chảy máu |
Khó đánh giá vì những vấn đề chảy máu nhẹ diễn ra phổ biến ở người khỏe mạnh. Sử dụng thang điểm chảy máu chuẩn hóa tỏ ra hữu ích (xem phần tài liệu tham khảo) |
|
|
Tiền sử gia đình |
Xác nhận sự hiện diện của bất cứ tiền sử gia đình nào nghi ngờ có rối loạn chảy máu |
|
|
Test ban đầu |
Công thức máu PT APTT Fibrinogene [PFA-100] |
|
|
Tỉ số VWF:RCo/VWF:Ag |
Tỉ số này giúp chẩn đoán các type 2A, 2B, 2M và giúp phân biệt với type 1. Nếu <0.7 hướng đến sự có mặt của rối loạn chức năng VWF. |
|
|
Tỉ số VWF:CB/VWF:Ag |
Tương tự như tỷ số ở trên. Type 2A: tỉ này thường thấp Type 2B: tỉ này thường thấp, nhưng có thể bình thường Type 2M: VWF:Ag có thể giảm hoặc bình thường, nhưng tỷ này <0.7 |
|
|
Tỉ số VWFpp/VWF:Ag |
Điều này hữu ích trong nghiên cứu Type 1 và giúp chia type 1 thành VWF có thời gian bán hủy bình thường và VWF có thời gian bán hủy ngắn (1C, Vicenza) |
|
|
Test LABO đặc hiệu |
Nghiên cứu gắn kết FVIII |
Có giá trị trong chẩn đoán type 2N, nhưng test này không phổ biến. Xét nghiệm gene VWF có giá trị tương đương |
|
Phân tích multimer |
Là xét nghiệm định tính, phân tích các multimer VWF có kích thước khác nhau. |
|
|
RIPA liều thấp |
Có giá trị trong chẩn đoán type 2B |
|
|
Các test LABO ban đầu có thể trong VWD |
VWF:Ag |
Xét nghiệm miễn dịch, cung cấp tổng số lượng VWF, không phản ánh chức năng |
|
VWF:Act |
Xét nghiệm chức năng, bằng dùng kháng thể đơn dòng gắn vào vị trí gắn thụ thể GpIb của VWF |
|
|
FVIII:C |
Đo hoạt tính đông máu của yếu tố VIII bằng phương pháp 1 giai đoạn |
|
|
Xét nghiệm chất ức chế VWF. |
Sàng lọc chất ức chế VWF bằng phương pháp xác định chất ức chế cổ điển (trộn huyết tương bình thường và huyết tương test, sau đó đo mức VWF) là rất khó. Xét nghiệm chất ức chế theo kiểu Bethesda chuẩn thường xuyên thất bại trong việc xác định chất ức VWF. Xét nghiệm ELISA đã được giới thiệu để tìm kiếm chất ức chế VWF, nhưng lại một lần nữa không phải luôn luôn xác định được kháng thể. Tiền sử có thể rất quan trọng trong những trường hợp này, một tiền sử không ghi nhận những rối loạn |
|
|
|
chảy máu thường xuyên mãi cho tới gần đây. Thời gian bán hủy của VWF truyền vào cũng giảm đáng kể và xác nhận điều này rất có giá trị. Đo tỉ số VWF:pp/VWF:Ag có thể rất hữu ích. |
|
TÀI LIỆU THAM KHẢO
VWD
Laffan M, Brown SA, Collins PW, Cumming AM, Hill FG, Keeling D, et al. The diagnosis of von Willebrand disease: a guideline from the UK Haemophilia Centre Doctors' Organization. Haemophilia. 2004 May;10(3):199-217.
Keeney S, Bowen D, Cumming A, Enayat S, Goodeve A, Hill M. The molecular analysis of von Willebrand disease: a guideline from the UK Haemophilia Centre Doctors' Organisation Haemophilia Genetics Laboratory Network. Haemophilia. 2008 Sep;14(5):1099-111.
Tosetto A, Rodeghiero F, Castaman G, Goodeve A, Federici AB, Batlle J, et al. A quantitative analysis of bleeding symptoms in type 1 von Willebrand disease: results from a multicenter European study (MCMDM-1 VWD). J Thromb Haemost. 2006 Apr;4(4):76673.
Rodeghiero F, Castaman G, Tosetto A, Batlle J, Baudo F, Cappelletti A, et al. The discriminant power of bleeding history for the diagnosis of type 1 von Willebrand disease: an international, multicenter study. J Thromb Haemost. 2005 Dec;3(12):2619-26.
Rodeghiero F, Tosetto A, Castaman G. How to estimate bleeding risk in mild bleeding disorders. J Thromb Haemost. 2007 Jul;5 Suppl 1:157-66.
Tosetto A, Castaman G, Rodeghiero F. Assessing bleeding in von Willebrand disease with bleeding score. Blood Rev. 2007 Mar;21(2):89-97.
Rodeghiero F, Kadir RA, Tosetto A, James PD. Relevance of quantitative assessment of bleeding in haemorrhagic disorders. Haemophilia. 2008 Jul;14 Suppl 3:6875.
Tosetto A, Castaman G, Rodeghiero F. Bleeding scores in inherited bleeding disorders: clinical or research tools? Haemophilia. 2008 May;14(3):415-22.
Bowman M, Riddel J, Rand ML, Tosetto A, Silva M, James PD. Evaluation of the diagnostic utility for von Willebrand disease of a pediatric bleeding questionnaire. J Thromb Haemost. 2009 Aug;7(8):1418-21.
Schneppenheim R, Budde U. von Willebrand factor: the complex molecular genetics of a multidomain and multifunctional protein. J Thromb Haemost 2011;9 Suppl 1:209-15
Favaloro EJ. Diagnosis and classification of von Willebrand disease: a review of the differential utility of various functional von Willebrand factor assays. Blood coagulation & fibrinolysis 2011;22:553-64.
Favaloro EJ. Rethinking the diagnosis of von Willebrand disease. Thromb Res 2011;127 Suppl 2:S17-21.
PHẦN 2: XÉT NGHIỆM MIỄN DỊCH
Kết quả VWF:Ag nên được biểu diễn bằng IU/dl hoặc IU/ml nếu xét nghiệm đã được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn quốc tế.
GIỚI THIỆU
VWF:Ag là xét nghiệm miễn dịch đo nồng độ VWF trong huyết tương. Chúng không cho biết hoạt tính của VWF. Một số phương pháp dùng để đo VWF:Ag bao gồm ELISA và hấp phụ miễn dịch latex [LIA]. Nhiều LABO hiện nay sử dụng phương pháp LIA.
NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP
Miễn dịch Latex:
Phương pháp này dùng các vi ống latex phủ kháng thể chống VWF người. Trong sự hiện diện của VWF, các vi ống này sẽ ngưng kết và tỉ lệ với nồng độ VWF:Ag trong mẫu.
Xét nghiệm ELISA
Bánh kẹp ELISA đo VWF:Ag bằng cách sử dụng kháng thể cố định ở trên dĩa bằng cách vi ống, đặc hiệu cho VWF người. Huyết tương bệnh nhân, chất kiểm soát và hàng loạt mẫu tham chiếu pha loãng được thêm vào, và VWF trong mẫu sẽ gắn kết với kháng thể. Dĩa sau đó được rửa để loại bỏ các VWF chưa gắn. Một kháng thể thứ 2 có gắn Horseradish Peroxidase (HRP). Một bước rửa thứ 2 được thực hiện và cơ chất cho HRP được thêm vào (Tetramethylbenzidine – TMB) theo sau bởi hydrogen peroxidase để tạo màu. Phổ hấp thụ tại 450nm được đo và từ đường cong tham chiếu, nồng độ VWF:Ag được suy ra. Việc sử dụng mẫu chứng với nồng độ VWF đã biết để đảm bảo rằng xét nghiệm là chính xác.
Một số kháng thể đơn dòng (gắn vào domain gắn GpIb của VWF) có thể phân biệt giữa type 2A và 2B.
PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
Diễn giải xét nghiệm VWF:Ag phải được làm trong bối cảnh với các xét nghiệm khác (FVIII:C và hoạt tính VWF), nhóm máu và tiền sử chảy máu. Hơn nữa, VWF là một protein pha cấp và sẽ tăng trong các trường hợp viêm, mang thai, phẫu thuật…
KHOẢNG THAM CHIẾU
Giá trị tham chiếu của VWF:Ag là 50-150 IU/dl.
ĐỀ NGHỊ XÉT NGHIỆM NÀO TIẾP?
Ở bệnh nhân nghi ngờ VWD, cần cố gắng sử dụng các xét nghiệm để phân type của bệnh, vì nó ảnh hưởng đến quyết định điều trị.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Christophe, O., Rouault, C., Obert, B., Pietu, G., Meyer, D. & Girma, J.P. (1995) A monoclonal antibody (B724) to von Willebrand factor recognizing an epitope within the A1 disulphide loop (Cys509-Cys695) discriminates between type 2A and type 2B von Willebrand disease. Br J Haematol, 90, 195-203.
Laffan, M., Brown, S.A., Collins, P.W., Cumming, A.M., Hill, F.G., Keeling, D., Peake, I.R. & Pasi, K.J. (2004) The diagnosis of von Willebrand disease: a guideline from the UK Haemophilia Centre Doctors' Organization. Haemophilia, 10, 199-217.
Gadisseur, A., Berneman, Z., Schroyens, W. & Michiels, J.J. (2009) Laboratory diagnosis of von Willebrand disease type 1/2E (2A subtype IIE), type 1 Vicenza and mild type 1 caused by mutations in the D3, D4, B1-B3 and C1-C2 domains of the von Willebrand factor gene. Role of von Willebrand factor multimers and the von Willebrand factor propeptide/antigen ratio. Acta Haematol, 121, 128-138.
Favaloro, E.J., Bonar, R. & Marsden, K. (2008) Lower limit of assay sensitivity: an under-recognised and significant problem in von Willebrand disease identification and classification. Clin Lab Sci, 21, 178-183.
Gombos, T., Mako, V., Cervenak, L., Papassotiriou, J., Kunde, J., Harsfalvi, J., Forhecz, Z., Pozsonyi, Z., Borgulya, G., Janoskuti, L. & Prohaszka, Z. (2009) Levels of von Willebrand factor antigen and von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS13) activity predict clinical events in chronic heart failure.
Thromb Haemost, 102, 573-580. Davies, J.A., Collins, P.W., Hathaway, L.S. & Bowen, D.J. (2009) C1584: effect on von Willebrand factor proteolysis and von Willebrand factor antigen levels. Acta Haematol, 121, 98-101.
PHẦN 3: XÉT NGHIỆM HOẠT TÍNH VWF ĐẶC HIỆU EPITOPE (VWF:ACT)
Xét nghiệm đặc hiệu epitope là xét nghiệm bán chức năng (semi-functional)
Xét nghiệm này sẽ cho ra kết quả bình thường ở bệnh nhân type 2N
Xét nghiệm ELISA sử dụng kháng thể chống trực tiếp epitope gắn GpIb của VWF bị chỉ trích vì chức năng của các multimer VWF kích thước lớn không được đo trực tiếp.
GIỚI THIỆU
Test này sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho vị trí gắn GpIb của tiểu cầu định vị trên domain A1 của phân tử von Willebrand và độc lập với ristocetin.
NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP
Xét nghiệm ELISA: Trong xét nghiệm này, các giếng kích thước micro đã được phủ kháng thể đơn dòng chống trực tiếp phần gắn GpIb của VWF. Mẫu huyết tương (tham chiếu, test và chuẩn) được pha loãng và cho vào các giếng. Dĩa được ủ để kháng thể cố định kháng nguyên. Những VWF đã gắn này, được nhận diện bởi một kháng thể anti-human có gắn HRP. Kháng thể anti-human này được định lượng bằng phản ứng so màu bằng cách thêm cơ chất của HRP là OPD (1,2 orthophenylendiamine dihydrochloride) và đo độ phổ hấp thụ tại 492nm. Phổ hấp thụ tỷ lệ với nồng độ VWF. Đường cong chuẩn được xây dựng bằng cách vẽ nhiều điểm trên đồ thị bậc nhất của VWF:Act và OD, từ đó nồng độ trong mẫu được suy ra. Test này độc lập với ristocetin.
Phương pháp ngưng kết latex tự động: Nó sử dụng những phần tử latex được phủ kháng thể đơn dòng chống lại domain gắn GpIb. Hoạt tính của VWF được xác định bằng cách đo độ đục được tạo ra do sự ngưng kết của phần tử latex như là hậu quả của việc tương tác với receptor GpIb của VWF. Test này độc lập, có thể tự động hóa hoàn toàn và được chạy trên một số máy phân tích.
PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
Sử dụng ELISA, đối với bệnh nhân type 1 hoặc 2A thì kết quả tương tự test hoạt tính VWF:RCo. Trong type 1, thì ELISA tương tự như đo mức kháng nguyên VWF:Ag. VWF:Act thấp hơn đáng kể so với VWF:Ag trong type 2A và 2B giúp phân biệt các dưới nhóm. Type 2M thì VWF:Act ở mức biên hoặc thấp. Type 3 thì VWF:Act rất thấp hoặc không xác định được.
Ngưng kết latex tương tự như ELISA
KHOẢNG THAM CHIẾU
Khoảng tham chiếu của xét nghiệm VWF:Act thường từ 50-150 IU/dl. Nhớ rằng VWF là một protein pha cấp vì vậy nó tăng lên trong thời gian stress, mang thai….
ĐỀ NGHỊ XÉT NGHIỆM NÀO TIẾP?
VWF:Act thường là một phần trong xét nghiệm chẩn đoán hoặc loại trừ bệnh lý VWD. Nó cũng được dùng để theo dõi điều trị.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Chand S, McGraw A, Hutton R, Tuddenham EGD, Goodall AH. A Two-Site Monoclonal Antibody-Based Immunoassay for von Willebrand Factor-Demonstration that vWF Function Resides in a Conformational Epitope. Thrombosis and Haemostasis. 1986;55(3):318-24.
Murdock PJ, Woodhams BJ, Matthews KB, Pasi KJ, Goodall AH. von Willebrand factor activity detected in a monoclonal antibody-based ELISA: an alternative to the ristocetin cofactor platelet agglutination assay for diagnostic use. Thromb Haemost. 1997;78(4):1272-7.
Xem tiếp: Các xét nghiệm đông máu: Xét nghiệm yếu tố Willebrand (P2)
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
