HCV đo tải lượng Real-time PCR

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích:

Xác định số lượng bản sao của virus viêm gan C (HCV) trong một đơn vị thể tích máu (copies / ml).

Nguyên lý:

Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time RT-PCR.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện:

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành vi sinh.

Phương tiện, hóa chất:

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị:

Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện.

Máy ủ nhiệt.

Máy ly tâm dung cho tube 0,2 ml.

Máy ly tâm 25000 x g.

Tủ lạnh 2ºC - 8ºC.

Tủ âm sâu (- 20ºC) hoặc (-70ºC) (nếu có).

Máy vortex.

Tủ an toàn sinh học.

Micropipettes các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao

Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 8 mẫu/lần thực hiện (VD).

Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần / 1 năm).

Bệnh phẩm:

Huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần.

Phiếu xét nghiệm:

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm:

Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh (xem phụ lục 3)

Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (xem phụ lục 6).

Tiến hành kỹ thuật:

Bộ sinh phẩm HCV qPCR (VD).

Tách chiết RNA:

Thực hiện phản ứng RT-PCR:

Thực hiện bước này với các tube RT-Mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Cho chứng +, chứng - hoặc dịch RNA tách chiết vào tube.

Lập chương trình cho máy PCR hoạt động.

Sản phẩm cDNA được dùng để thực hiện phản ứng PCR.

Nếu chưa thực hiện phản ứng PCR ngay, phải bảo quản cDNA ở -20ºC.

Thực hiện phản ứng real-time PCR:

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

Cho cDNA từ phản ứng RT ở trên vào từng tube HCV qPCR Mix. Sau đó đặt các tube vào máy real-time PCR cùng với 1 bộ standard.

Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình real-time PCR.

Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

Chọn màu “FAM” cho standard. Màu “FAM” và “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.

Lưu file dữ liệu vào máy tính.

Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Điều kiện của phản ứng:

Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc âm tính.

Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính.

Phân tích standard:

Hệ số tuyến tính (R2) phải nằm trong khoảng 0.960-1.000, tốt nhất 0.9901.000.

Hiệu suất nhân bản (PCR efficiency) phải nằm trong khoảng 90-115%, tốt nhất 95 - 110%.

Hệ số dốc (Slope) phải nằm trong khoảng -3 đến -4, tốt nhất -3.3 đến -3.6.

Phân tích mẫu:

Ngưỡng phát hiện của bộ kit là 3x102 copies / ml.

Những mẫu dương tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tích.

Các kết quả dương tính được nhân với hệ số pha loãng sẽ thu được kết quả hàm lượng virus/ml máu (copies / ml), do đó kết quả sau khi nhân:

Nếu ≥ 3x102 thì kết luận “Mẫu dương tính: a copies / ml”.

Nếu < 3x102 thì kết luận “Mẫu dương tính dưới ngưỡng định lượng”.

Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.

In đồ thị kết quả.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

Nguyên nhân:

Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.

Khắc phục:

Pha loãng mẫu từ 10 - 100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.

Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

facebook.com/BVNTP