MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
Mục đích:
Xác định sự có mặt của Neisseria gonorrhoeae trong bệnh phẩm dịch niệu đạo, cổ tử cung hoặc dịch cơ thể có nghi ngờ có căn nguyên N. gonorrhoeae.
Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học và chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Phương tiện, hóa chất
Trang thiết bị
Tủ an toàn sinh học cấp 2
Máy ủ nhiệt
Máy ly tâm > 12000 gpm/phút
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
Máy vortex
Máy Real-time PCR
Ống Eppendorf 1,5 ml ho c 2 ml
Các loại Micropipette đi u chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl
Đầu côn có màng lọc 10 μl, 100 μl, 200 μl và 1000 μl
Tủ lạnh thường
Tủ âm sâu (20oC) hoặc (-70oC) (nếu có)
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Dịch niệu đạo, cổ tử cung ho c dịch cơ thể có nghi ngờ có căn nguyên N.gonorrhoeae.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh
Tiến hành kỹ thuật
VD bộ sinh phẩm chẩn đoán LightPower CHT/NGN rPCR Plus (hoặc sinh phẩm tương đương)
Tách chiết DNA theo hướng dẫn sử dụng của Kit tách chiết DNA.
Thực hiện phản ứng Real-time PCR.
Đọc kết quả
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
-
Bước 1: Kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm
-
Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX
-
Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu.
-
Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.
-
-
Bước 2: Kiểm tra độ nhạy
-
Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX
-
Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR không bị ức chế.
-
Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại hoặc tín hiệu thấp với kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.
-
-
Bước 3: Xác định mẫu dương tính Neisseria gonorrhoeae
-
Chọn từng mẫu , chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM
-
Mẫu có tín hiệu huỳnh quang với kênh màu FAM và có Ct: là những mẫu dương tính Neisseria gonorrhoeae
-
Các mẫu có Ct <12 và tín hiệu huỳnh quang không tăng theo chu kỳ nhiệt:
-
pha loãng DNA mẫu với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix
-
-
Bước 4: Xác định mẫu âm tính Neisseria gonorrhoeae
-
Chọn từng mẫu, chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và
-
HEX
-
Mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu HEX, thì kết quả là mẫu âm tính với Neisseria gonorrhoeae
-
Nếu mẫu có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM nhưng không có Ct và dương tính với màu HEX, thì kết quả là Neisseria gonorrhoeae trong bệnh phẩm dưới ngưỡng phát hiện
Nếu mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu HEX, thì mẫu bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường
Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế
Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
