CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm:
Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh (xem phụ lục 3).
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (xem phụ lục 6).
Tiến hành kỹ thuật :
Bộ sinh phẩm NHS Meningitidis Real-TM (Sacace - VD).
Thu nhận và xử lý mẫu.
Tách chiết DNA.
Thực hiện phản ứng real-time PCR.
Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay đá lạnh hoặc đá đang tan.
PCR 0.2 ml.
Chỉ lấy đủ số tube PCR 0.2 ml cần. Chuẩn bị MasterMix và phân phối vào các tube sau đó ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube.
Cho các chứng dương, chứng âm và IC (internal control) hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube PCR mix. Xong đặt các tube vào máy realtime PCR.
Khởi động máy realtime PCR. Khởi động máy tính và chương trình real-time PCR.
Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đặt trên máy real-time PCR.
Chọn màu “FAM” và “JOE” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy realtime PCR hoạt động.
Lưu file dữ liệu vào máy tính.
Cho máy realtime chạy chương trình.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Điều kiện của phản ứng:
Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dương tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính.
Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính, đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE âm tính.
Phân tích mẫu:
Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng với màu bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước.
Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu từ sau chu kỳ 36 → đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm.
Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.
In đồ thị kết quả.
NHỮNG SAI SÓT CẦN XỬ TRÍ
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
Nguyên nhân:
Có thể mẫu âm thật sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục:
Pha loãng mẫu từ 10 - 100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
