Virus Real - time PCR

✴️ Virus Real - time PCR

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích:

Xác định DNA hoặc ARN đặc trưng của virus cần tìm.

Nguyên lý:

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện:

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành vi sinh (và / hoặc sinh học phân tử / sinh học / công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành vi sinh (và / hoặc sinh học phân tử / sinh học / công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương):

Trang thiết bị:

Tủ an toàn sinh học cấp 2.

Máy ủ nhiệt.

Máy ly tâm bàn dùng cho ống bệnh phẩm 5 ml.

Máy ly tâm lạnh dùng cho tube 0,2 ml.

Máy vortex.

Máy chạy PCR.

Máy chạy Real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Các loại Micropipette đi u chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl.

Tủ lạnh thường.

Tủ âm sâu (-200C) hoặc (-700C) (nếu có).

Bộ lưu điện.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm).

Ghi chú:

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần / 1 năm).

Bệnh phẩm:

Các loại bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm virus cần tìm.

Phiếu xét nghiệm:

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm:

Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh.

Tiến hành kỹ thuật:

Thu nhận và xử lý mẫu:

Tất cả loại bệnh phẩm khi chứa nhiều tạp nhiễm cần được thuần nhất trước khi tách chiết.

Tách chiết DNA hoặc RNA từ bệnh phẩm bằng bộ kit tách DNA tổng số hoặc RNA tổng số.

Chạy phản ứng RT-PCR dùng mồi ngẫu nhiên với virus có bộ gen là RNA (bỏ qua bước này nếu kít sử dụng real-time PCR có chứa luôn phản ứng RT-PCR).

Bật máy PCR 15 phút trước khi chạy phản ứng RT-PCR.

Thực hiện bước này với các tube RT-PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube RT-PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng RTPCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

Cho dịch RNA tách chiết vào từng tube RT-PCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy PCR.

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy PCR hoạt động theo hướng dẫn của bộ kit RT-PCR.

Cho máy PCR chạy chương trình.

Chạy phản ứng Real-time PCR.

Bật máy real-time PCR 15 phút trước khi cho máy chạy. Bật máy tính và khởi động chương trình real-time PCR.

Thực hiện bước mix với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

Cho chứng +, chứng -, các nồng độ standard, dịch DNA vừa tách (hoặc dịch cDNA vừa thu nhận được (hoặc RNA vừa tách được nếu kít Real-time PCR có chứa phản ứng RT-PCR)) vào từng tube Real-time PCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.

Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

Chọn màu cho mẫu, chứng dương, chứng âm, standart theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng.

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.

Lưu file dữ liệu vào máy tính.

Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Nhận định kết quả qua phân tích của máy dựa trên cơ sở hướng dẫn của bộ kít Real-time PCR được sử dụng.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Phản ứng dương tính giả: Do tạp nhiễm từ môi trường.

Phản ứng âm tính giả: Do phản ứng PCR bị ức chế hoặc do máy Realtime PCR bị hỏng.

Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh