MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
Mục đích
Xác định RNA đặc trưng của Zika virus
Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time RT - PCR một bước.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)
Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện
Máy ủ nhiệt
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
Máy ly tâm lạnh > 12000 gpm/phút
Tủ lạnh 20C -80C
Tủ âm sâu (-200 C) hoặc (-700C) (nếu có)
Máy vortex
Tủ an toàn sinh học
Micropipettes và các thể tích từ 0,5 µl - 1000 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
.png)
.png)
Ghi chú:
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Máu toàn phần, huyết thanh, huyết tương, nước tiểu, mẫu mô và các dịch sinh học khác. Tốt nhất là huyết thanh và nước tiểu.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).
Tiến hành kỹ thuật
Bộ sinh phẩm VIASURE Zika, Dengue and Chikungunia Real-time PCR
Detection Kit (VD hoặc tương đương)
Thu nhận và xử lí mẫu
Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết RNA nếu cần.
Tách chiết RNA:
Tách chiết bằng tay hoặc tự động.
Hồi chỉnh chứng dương
Thực hiện phản ứng real-time PCR
Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Bóc lớp vỏ nhôm che phủ trên đĩa hoặc tube phản ứng.
Cho dung dịch hồi chỉnh vào mỗi giếng.
Cho chứng +, chứng – hoặc dịch RNA tách chiết vào từng giếng, đậy nắp, ly tâm nhẹ. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.
Bật máy real-time PCR. Bật máy tính khởi động chương trình real-time PCR trước khi chạy mẫu ít nhất 15 phút.
Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
Chọn màu Cy5 (Zika), FAM (Dengue), ROX (Chikungunya) cho mẫu, chứng dương và chứng âm và HEX (hoặc JOE/VIC) cho chứng nội.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động
Lưu file dữ liệu vào máy tính
Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Điều kiện của phản ứng
Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu Cy5, FAM, ROX tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính).
Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu Cy5, FAM, ROX âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính.
Phân tích mẫu
Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng tương ứng với màu của từng tác nhân và bắt đầu từ chu kỳ 40 trở về trước. Mẫu dương tính với Zika virus khi đường biểu diễn tương ứng với màu Cy5 dương tính. Một mẫu có thể dương tính với 1 trong 3 tác nhân hoặc dương tính đồng thời cả 3 tác nhân.
Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu từ sau chu kỳ 40→ đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét nghiệm sau 1-3 tháng.
Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Sự cố:
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
Nguyên nhân:
Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục:
Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu.
Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
