CÁC NGUYÊN LÝ ĐÁNH GIÁ ANTISENSE
Cũng như các loại thuốc mới khác, việc trị liệu bằng oligonucleotid cũng cần phải trải qua quá trình đánh giá một cách hệ thống và lâu dài trong các thử nghiệm tiền lâm sàng và lâm sàng (Hình 4.2 và 4.3). Hoạt tính sinh học của một thuốc antisense bao hàm các hiệu ứng mong muốn và không mong muốn có thể bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác nhau từ mức phân tử, tế bào, tổ chức /mô hay toàn cơ thể (Bảng 4.3 và 4.4). Các antisense oligonucleotid có thể gây các hiệu ứng sinh học lên các gen đích thông qua một vài cơ chế riêng biệt bao gồm cả cơ chế antisense và không antisense trên các tế bào hoặc mô đích hay không đích.
Hơn nữa, việc chuyển giao các thuốc antisense tới được các tế bào đích là vấn đề then chốt đi đến thành công. Trong các nghiên cứu in vivo, các lipid thường được sử dụng để tạo thuận lợi cho sự hấp thu của tế bào đối với các oligonucleotid. Nhưng cũng cần phải lưu ý rằng, tỷ lệ lipid đối trong các oligonucleotid sẽ tác động tới kết quả hấp thu cũng như các hoạt tính sinh học của oligonucleotid. Độc tính TB của riêng một lipid xác định cũng cần phải được lý giải trong các kết quả in vivo. Trái lại trong các nghiên cứu in vivo thì việc hấp thu oligonucleotid dường như là tốt hơn so với các thí nghiệm in vitro. Do vậy có lẽ cũng không cần phải sử dụng một phương tiện vận chuyển đặc biệt cho các oligonucleotid.
Đánh giá dược lý học
Đã có một số lượng lớn các báo cáo mô tả các tính chất dược động học của nhiều loại antisense oligonucleotid. Các antisense oligonucleotid với các chiều dài và các thành phần base khác nhau đã được đánh giá ở các mẫu khác nhau như ở chuột lớn, chuột nhắt, thỏ, khỉ và người với các phương thức đưa vào cơ thể khác nhau (qua tĩnh mạch, trong màng bụng, dưới da, trong cơ, uống và hít). Trong hầu hết các trường hợp, hàm lượng oligonucleotid gốc (parent) và các sản phẩm đã bị phân giải (trong một số trường hợp) được báo cáo là trên các mẫu huyết tương.
Trong một số nghiên cứu khác người ta đã phân phối các oligonucleotid tới nhiều mô khác. Nhìn chung là PS-oligos có đời sống phân phối bán phần huyết tương ngắn t1/2 dưới 1 giờ và đời sống loại thải bán phần lại rất dài t1/2 ở thang 40 -60 giờ.
Dược động học huyết tương của các oligonucleotid không liên quan tới chiều dài hay trình tự bậc nhất, trừ trường hợp các oligonucleotid đã cải biến khung và có các đoạn đặc hiệu ở đầu 3 và /hoặc đầu 5. Các antisense oligonucleotid được phân phối nhiều với nồng độ cao nhất ở gan và thận. Bài tiết qua nước tiểu có lẽ là con đường loại thải chính.
Việc duy trì oligonucleotid trong các mô đích và các mô bình thường liên quan trực tiếp tới tính ổn định in vivo. Để tăng hiệu ứng trị liệu cần phải tăng thời gian duy trì của các oligonucleotidònguyên vẹn trong cơ thể bằng cách làm tăng tính ổn định in vivo và giảm bài tiết. Các nghiên cứu tại phòng thí nghiệm cho thấy các MBO kéo dài sự duy trì tại mô hơn các PS-oligos. Tuy nhiên, vì sự phân phối mô không đặc hiệu và có sự tích lũy nên khi duy trì các mức (nồng độ) cao và kéo dài oligonucleotid trong các mô vật chủ thì có thể sẽ làm tăng rủi ro. Hơn nữa, độc tính và sự rủi ro này có thể tăng hơn nữa tùy thuộc trạng thái bệnh của từng cá thể cũng như chức năng của các tổ chức như gan và thận.
Đánh giá hiệu lực antisense
Có lẽ khía cạnh quan trọng nhất của các antisense oligonucleotid là hiệu ứng đích và tính đặc hiệu của các tác nhân antisense này (Hình 4.2, Bảng 4.3). Các oligonucleotid đã được thiết kế thường được test ở cả mức in vitro và in vivo (Hình 4.2). In vitro các thử nghiệm dựa trên cơ sở TB hoăc phi TB đã được sử dụng một cách thường quy để xác lập nền tảng cho những nghiên cứu xa hơn. Sự hấp thu TB của các oligonucleotid được test có lẽ phụ thuộc vào dạng TB, nồng độ thuốc, các điều kiện nuôi cấy TB và hệ thống chuyển giao. Nói chung, có thể chấp nhận được rằng phần lớn các oligonucleotid có thể vượt qua màng TB vào tận tế bào chất với một hàm lượng đủ để đạt tới hiệu ứng mong muốn.
Để tăng hấp thu TB in vitro, một vài phương tiện chuyển giao như liposome hoặc phospholipid đã được sử dụng có tính chất thường quy để tránh việc phải sử dụng nồng độ antisense cực kỳ cao trong những ngày đầu nghiên cứu.
Hình 4.2. Đánh giá tiền lâm sàng các antisense oligonucleotid với tư cách là các thuốc kháng ung thư.
(Theo Ruiwen Zhang và Hui Wang. (2005) Cancer Gene Therapy. Human Press. Totowwa, New Jersey)
Hình 4.3. Đánh giá lâm sàng các antisense oligonucleotid được sản xuất theo tiêu chuẩn GMP với tư cách là các thuốc chống ung thư.
(Theo Ruiwen Zhang và Hui Wang. (2005) Cancer Gene Therapy. Human Press. Totowwa, New Jersey)
Để chứng minh tính đặc hiệu của các oligonucleotid được test, mức độ biểu hiện của gen đích, người ta thường sử dụng phương pháp Western blot, phản ứng tổng hợp chuỗi phiên mã ngược (reverse transcriptase polymerase chain reaction RTPCR) và / hoặc các phân tích Northern blot. Nếu muốn khảo sát sự ức chế biểu hiện protein và những tác động lên sự chuyển hóa mRNA của các gen đích theo thời gian, liều lượng, cách thức phụ thuộc trình tự thì phải xác định được hiệu ứng đặc hiệu antisense. Cũng phải thực hiện các kiểm chứng đặc biệt (chưa xử lý, oligo không thích hợp, các lipid). Để chứng minh xa hơn nữa tính đặc hiệu của các antisense oligonucleotid được test thì việc kiểm soát các protein hay các gen quản gia chẳng hạn như actin cũng phải được phân tích đồng thời.
Các thử nghiệm nhằm xác định những biến đổi, sự tăng sinh và apoptosis TB cũng được sử dụng để vẽ được bức tranh tổng thể về hoạt tính kháng u của các oligonucleotid được test khi so sánh với các đối chứng. Tuy nhiên, những thử nghiệm này cũng có thể tạo ra các kết quả dương tính giả hay âm tính giả. Chẳng hạn như, một số lipid được dùng để nâng cao sự hấp thu oligonucleotid lại có độc tính đối với TB. Vì thế, các kiểm chứng đặc biệt (âm tính, dương tính, không xứng đôi) là rất cần thiết. Các đáp ứng về liều lượng, thời gian và sự phụ thuộc trình tự là những bằng chứng tốt đối với hiệu ứng antisense cũng như việc thiết lập nền tảng cho những đánh giá in vivio xa hơn cho các oligonucleotid được test.
Bảng 4.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới kết quả và lý giải các thí nghiệm tiền lâm sàng.
Bằng chứng về hoạt tính kháng u in vivo của các antisense oligonucleotid là rất quan trọng đối với việc phát triển đường dây thông tin. Nhưng thật khó mà tạo được các kết quả làm cho người ta tin tưởng như là với các test in vitro. Các mô hình trên các loại chuột như mô hình ghép ngoại lai trên chuột nude và SCID trên chuột nhắt cũng như các mô hình chuột chuyển gen cũng thường hay được sử dụng nhất trước khi đi tới các thử nghiệm lâm sàng. Đích cuối cùng của hiệu ứng này là các số liệu về khối lượng khối u, sự di căn, sự sống sót, các marker phân tử và sự đánh giá mô bệnh học.
Có 3 mô hình test có thể được sử dụng - phụ thuộc vào lịch trình và thời gian điều trị. Thứ nhất là hiệu ứng đối với khởi đầu ung thư và việc tạo ra các oligonucleotid. Vấn đề này có thể xác định được khi sử dụng một protocol ex vivo trong đó các TB đã được xử lý với các antisense oliogonucleotide trước khi ghép ngoại lai TB. Tốc độ hình thành khối u và sự ức chế tăng trưởng có thể được coi như là đích chính trong các mô hình này.
Thứ hai là, hiệu ứng ức chế tăng trưởng khối u của các oligonucleotid test có thể được thực nghiệm với việc sử dụng một proptocol xử lý in vivo, trong đó việc xử lý bằng oligonucleotid được bắt đầu ở giai đoạn sớm của tăng trưởng khối u, thường là khi khối u đạt tới 50-100mg. Trong các mô hình này, ức chế tăng trưởng khối u và các marker phân tử / bệnh lý là đích chính cuối cùng.
Thứ ba là, hoạt tính kháng u của các oligonucleotid có thể được test ở các khối u giai đoạn muộn, khi đó người ta sử dụng một protocol mà việc xử lý bằng oligonucleotid bắt đầu khi khối lượng khối u đạt tới 500-1000mg, tùy thuộc vào từng dạng khối u. Trong những mô hình này, ức chế tăng trưởng khối u và sự sống sót có thể là đích chính cuối cùng.
Bảng 4.4. Các yếu tố có thể ảnh hưởng tới các kết quả và sự lý giải của các thử nghiệm lâm sàng.
Việc thiết kế mối tương quan đáp ứng liều trong các mô hình in vivo là rất quan trọng. Các kiểm chứng đặc biệt (không xử lý, chất dẫn thuốc, oligonucleotid) cũng cần được đề cập, Bằng chứng in vivo về việc ngăn chặn biểu hiện gen đặc hiệu cũng là điều mà người ta mong mỏi. Cần phải chỉ rõ rằng, hoạt tính kháng u in vivo của một antisense oligonucleotid đã biết không nhất thiết phải là kết quả tất yếu của cơ chế antisense mà nó còn có thể liên quan tới cả hoạt tính không đặc hiệu và /hoặc hoạt tính kháng antisense đặc hiệu trình tự.
Trị liệu kết hợp
Mặc dầu hầu hết các antisense oligonucleotid được test in vivo với tư cách là trị liệu đơn, nhưng các phương pháp điều trị kết hợp giữa antisense oligonucleotid và các tác nhân hóa trị thông thường, các kháng thể kháng ung thư và xạ trị cũng được nghiên cứu với diện rộng. Có nhiều nghiên cứu lâm sàng đã chứng minh rằng sự điều hòa xuống các sản phẩm gen đặc hiệu với antisense oligonucleotid làm các TB ung thư nhạy cảm với các tác nhân hóa trị, kết quả là có hoạt tính cộng hoặc đồng thuận kháng ung thư. Đích của các antisense này là receptor yếu tố tăng trưởng bì của chuột double minutes 2 (MDM2), protein kinase c-myc phụ thuộc AMP vòng (cAMP), protein kinase C và Bcl-2. Những antisense oligonucleotid này làm tăng hiệu ứng trị liệu của các tác nhân hóa trị như paclitaxel, 5-fluorouracil, cisplatin, carboplatin, taxotere, camtothecin, irinotecan, leucovorin, gemcitabin, mefosfamid, doxorubicin, adramycin và dacarbazin.
Tuy nhiên, cơ chế đáp ứng cho hiệu ứng cộng hay đồng thuận như thế giữa các antisense oligonucleotid và các tác nhân hóa trị thì vẫn chưa được rõ hoàn toàn. Có thể cả yếu tố động dược học và dược động lực đều có thể liên quan tới cơ chế này (Bảng 4.3). Sự đồng thuận giữa 2 lớp tác nhân có thể dẫn đến từ sự tương tác trên một số cơ chế, chẳng hạn như sự làm ngừng chu kỳ tế bào, cảm ứng apoptosis, cảm ứng đáp ứng miễn dịch và sản xuất các cytokin. Mặc dầu hầu hết các nghiên cứu đã chỉ ra rằng hiệu ứng cộng hay đồng thuận như thế là do sự đặc hiệu trình tự, nhưng các nghiên cứu khác lại chứng minh rằng các antisense oligonucleotid cũng có thể làm cho irinotecan có tiềm lực kháng u trong phương thức độc lập trình tự - có thể là thông qua một tương tác ở mức dược động học và / hoặc chuyển hóa đã làm tăng sự chuyển đổi của các chất chuyển hóa hoạt tính.
Các thử nghiệm lâm sàng
So với các thử nghiệm tiền lâm sàng thì các nghiên cứu lâm sàng về oligonucleotid có số báo cáo ít hơn (Bảng 4.2). Hầu hết các antisense oligonucleotid đã được test là các PS-oligos, sơ bộ cho thấy độ nan toàn là có thể chấp nhận được và có hiệu lực kháng u ở giai đoạn khởi đầu trên người. Các antisense oligonucleotid đã được test với tư cách là trị liệu đơn cũng như trị liệu kết hợp với các tác nhân hóa trị khác.
Trong hầu hết các kết quả thử nghiệm pha I đã được báo cáo thì các antisense oligonucleotid có độ an toàn tốt. Các tác dụng phụ bao gồm: giảm tiểu cầu, kéo dài thời gian tạo cục đông đã được hoạt hóa cục bộ, tăng nhẹ các men gan. Độc tính với thận và gan không đánh kể. Các nghiên cứu động dược học được thực hiện trên các bệnh nhân đã chỉ rõ rằng: đời sống bán phần của sự phân phối huyết tương là ngắn nhưng lại kéo dài đời sống bán phần bài tiết. Bài tiết qua nước tiểu là con đường chính với các sản phẩm đã bị phân giải. Ngày nay, các antisense oligonucleotid đã thể hiện có thể ức chế được sự biểu hiện các gen đích và đáp ứng kháng u khởi đầu một cách đặc hiệu. Những hạn chế của các thử nghiệm pha II và III cũng đã được báo cáo và thấy cũng cần phải có các nghiên cứu xa hơn nữa. Trên thực tế, tương lai của trị liệu antisense sẽ còn phụ thuộc vào những thành công trong các thử nghiệm lâm sàng.
Đánh giá độ an toàn
Các nghiên cứu kỹ lưỡng về độc chất học là chìa khóa cho sự phát triển thuốc antisense. Cũng có một vài giới hạn về độc chất học đã được báo cáo trong các đánh giá về antisense oligonucleotid, mặc dầu có nhiều phosphorothiat đã được nghiên cứu mở rộng về độ an toàn của chúng trên một vài mẫu như chuột nhắt, chuột lớn, khỉ và người. Các hiệu ứng phụ lệ thuộc liều trong các thí nghiệm ở chuột lớn và chuột nhắt bao gồm: giảm tiểu cầu, phì đại lách và tăng transaminase. Những biến đổi mô bệnh học bao gồm: thâm nhiễm TB đơn nhân trong các mô như gan, thận và lách cũng như tăng sản các TB lưới nội mô và các TB lympho. Sự khốc liệt của các hiệu ứng phụ phụ thuộc vào liều lượng, tần suất và thời gian sử dụng các oligonucleotid. Nhìn chung khái lược về độc chất học của các PS-oligos có các thành phần base và chiều dài khác nhau là tương tự nhau, trừ khi có sự hiện diện của một motif trình tự xác định chẳng hạn như CpG -dinucleotid và motif poly -G. Những motif này góp phần làm nghiêm trọng thêm về độc chất học.
Các nghiên cứu về độc chất học tiền lâm sàng đã được sử dụng để chỉ dẫn cho kế hoạch thử nghiệm lâm sàng về về liều khởi đầu và liều tăng dần. Để củng cố cho các thử nghiệm lâm sàng pha I, người ta nghiên cứu độc chất học trên động vật với việc sử dụng 2 mẫu động vật, thường là một mẫu là loài gặm nhấm và một mẫu không phải là gặm nhấm. Đối với các antisense oligonucleotid thì các động vật cao cấp không phải là người thường được sử dụng trong các thử nghiệm. Hơn nữa, các nghiên cứu độc chất học đặc hiệu cũng được đề xướng để xác định độc chất học tim, độc chất học gan và độc chất học miễn dịch.
KẾT LUẬN
Mặc dầu đã có những tiến bộ đáng kể trong thập kỷ qua, nhưng các antisense oligonucleotid vẫn chưa được phát triển với tư cách là một phương pháp trị liệu hợp thức. Một trong số các khía cạnh quan trọng nhất của việc phát triển các antisense oligonucleotid là phê chuẩn các các đích thuốc và nâng cao hiệu lực cũng như tính đặc hiệu đích của các thuốc antisense này. Với việc ngày càng gia tăng các antisense oligonucleotid kháng ung thư đã được đánh giá trên lâm sàng thì hy vọng sẽ có các tác nhân trị liệu một cách đơn lẻ hay kết hợp cùng với các tác nhân trị liệu khác. Các nghiên cứu tương lai rất cần thiết vì nó không chỉ là cung cấp các nguyên lý cơ bản của công nghệ antisense in vitro và in vivo mà còn làm thỏa mãn đầy đủ các nhu cầu của trị liệu. Các nghiên cứu cơ bản cũng rất cần thiết nhằm khám phá ra các cơ chế tác động tới các hoạt tính sinh học của các oligonucleotid. Với các thuốc antisense thế hệ mới đã được sáng chế và kiểm định, hy vọng rằng hiệu ứng trị liệu và độ an toàn của các tác nhân này sẽ được nâng cao một cách đáng kể.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
