MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
Mục đích
Phát hiện gen mã hóa cho 2 loại độc chất A và B của vi khuẩn Clostridium difficile từ mẫu phân.
Nguyên lý
Bằng kỹ thuật PCR sử dụng bộ kit C. difficile A/B (VD).
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Máy ủ nhiệt.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.
Máy ly tâm 25000 x g.
Tủ lạnh 2°C - 8°C.
Tủ âm sâu (-20°C) hoặc (-70°C) (nếu có).
Máy vortex.
Tủ an toàn sinh học.
Micropipettes các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 2 mẫu/lần thực hiện (VD).
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Thu thập các mẫu phân vào các ống chứa kín, không cần chất bảo quản.
Mẫu phải được bảo quản ở 2 - 8ºC và làm xét nghiệm ngay lập tức hoặc giới hạn trong 24 giờ. Trong trường hợp khác, mẫu phải được đông lạnh ngay lập tức và được trữ lên tới 10 ngày ở nhiệt độ -20ºC hoặc lạnh hơn.
Sự rã đông không được ảnh hưởng đến kết quả.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 3).
Tiến hành kỹ thuật
Chuẩn bị mẫu.
Tách chiết DNA.
Cài đặt máy luân nhiệt.
Chuẩn bị cho PCR mix.
Chạy phản ứng PCR.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
|
FAM |
HEX |
Kết quả |
|
Ct > 0 |
Không liên quan (Ct >0) |
Dương tính |
|
Ct = 0 |
Ct > 0 |
Âm tính |
|
Ct = 0 |
Ct = 0 |
Bị ức chế |
Kết quả chỉ có giá trị nếu:
Mẫu blank phải dương tính ở kênh HEX, nhưng âm tính ở kênh FAM.
Chứng dương phải dương tính ở kênh FAM.
Nếu 2 điều kiện gặp nhau, kết quả có giá trị và có khả năng phân tích kết quả.
Ngoài ra các kết quả khác đều không có giá trị.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Vấn đề 1
Không tín hiệu.
Sai kênh được chọn.
Hút sai dẫn tới bỏ quên 1 số thuốc thử hoặc mẫu.
Tác động ức chế của mẫu: DNA không đủ lượng hoặc không đủ độ tinh sạch.
Kiểm tra bộ kit được bảo quản đúng.
Kiểm tra hoạt động của máy luân nhiệt.
Vấn đề 2
Mật độ huỳnh quang quá thấp.
Hư thuốc nhuộm và/hoặc primers trong thuốc thử do điều kiện bảo quản không phù hợp.
Lượng mẫu và/hoặc độ tinh sạch thấp của DNA.
Vấn đề 3
Mật độ huỳnh quang thay đổi.
Master mix không được phối trộn tốt.
Bọt khí có trong ống PCR.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
