✴️ PCR chẩn đoán bệnh Alpha Thalassemia (05 đột biến)

NGUYÊN LÝ

Phản ứng tổng hợp chuỗi (PCR) là phản ứng cho phép nhân bản chính xác một trình tự ADN quan tâm lên hàng triệu lần. Sử dụng phương pháp PCR thông thường với một cặp mồi đặc trưng chỉ phát hiện được một đột biến. Để phát hiện nhiều hơn một đột biến sẽ phải làm nhiều xét nghiệm PCR. Có rất nhiều loại đột biến gây bệnh Anpha Thalassemia. Trong trường hợp này sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR là giải pháp tối ưu. Đây là phương pháp sử dụng nhiều cặp mồi trong cùng một phản ứng PCR. Như vậy chỉ cần một phản ứng Multiplex PCR chúng ta đã có thể phát hiện được nhiều đột biến cùng một lúc.

CHỈ ĐỊNH

Sử dụng cho tất cả người bệnh có chẩn đoán Alpha - Thalassemia.

CHỐNG CHỈ ĐỊNH

Không có chống chỉ định.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện:

Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã được đào tạo.

Phương tiện - Hóa chất:

Phương tiện:

Máy PCR;

Hệ thống máy điện di, hệ thống đèn cực tím soi gel, hệ thống máy chụp ảnh;

Buồng vô trùng (biology cabinet);

Máy ly tâm tốc độ cao (tốc độ tối đa 14.000 vòng/phút);

Máy vortex;

Các loại pipet 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;

Đầu côn có màng lọc;

Ống eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;

Tủ lạnh 4 - 80C, tủ âm sâu - 200C;

Găng tay.

Hóa chất:

Kit tách ADN thương mại hoặc các hóa chất cần thiết cho tách chiết thủ công ADN (proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối).

Hóa chất chạy PCR gồm: Đệm, MgCl2, dNTPs, enzym kéo dài chuỗi, nước khử ion vô trùng.

Các mồi đặc hiệu gồm 12 mồi để xác định đồng thời 5 đột biến mất đoạn; đồng thời cho biết tính đồng hợp, dị hợp tử đột biến và 1 cặp mồi sử dụng làm chứng nội kiểm (Internal control). Theo bảng sau:

Thạch agarose, đệm tra mẫu, thang chuẩn ADN.

Thuốc nhuộm ethidium bromide.

Bệnh phẩm:

ml máu ngoại vi đựng trong ống chống đông EDTA.

Phiếu xét nghiệm:

Có đầy đủ các thông tin cần thiết về người bệnh, về chẩn đoán và yêu cầu xét nghiệm.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Lấy bệnh phẩm:

2 ml máu ngoại vi chống đông bằng EDTA.

Tiến hành kỹ thuật:

Tách chiết ADN.

Thực hiện phản ứng Multiplex PCR phát hiện 5 đột biến bệnh alpha thalassaemia.

Ly tâm nhẹ để các thành phần lắng xuống đáy ống hoàn toàn.

Đặt vào máy PCR.

Chọn chương trình.

Bấm start để máy chạy.

Điện di sản phẩm PCR.

Chuẩn bị gel agarose.

Cân 1 g agarose cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt.

Thêm 100 ml đệm điện di (TAE 1X /TBE 1X...) vào bình, lắc đều.

Đun mỗi lần 1 phút trong lò vi sóng đến khi agarose tan hoàn toàn.

Để ấm đến 600 rồi đổ vào khay đã cắm lược.

Để nhiệt độ phòng 30 phút để thạch đông rồi mới rút lược ra.

Điện di:

Lấy 5 µl sản phẩm PCR + 1 µl đệm tra mẫu + 4 µl dH20.

Trộn đều và nhỏ vào các giếng theo thứ tự.

Nhỏ 3 µl marker ADN vào giếng kế tiếp.

Đặt bản gel vào máy điện di.

Đổ đệm điện di ngập bản gel và chạy ở 100 V trong 20 phút.

Nhuộm bản gel với dung dịch ethidium bromide trong 5 phút.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Kết quả dương tính nếu nhìn thấy vạch sáng dưới đèn UV, sản phẩm có kích thước phù hợp theo lý thuyết.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Chong et al., Single - tube multiplex - PCR screen for common deletional determinants of a - thalassemia. Blood 2000;95: 360–362.

Old JM DNA - based diagnosis of the hemoglobin disorders. In: Steinberg MH,

Forget PG, Higgs DR, Nagel RL (eds) Disorders of Hemoglobin: Genetics, Pathophysiology, and Clinical Management. Cambridge University Press, Cambridge, UK(2001). pp 941 - 57.

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

  facebook.com/BVNTP

  youtube.com/bvntp