MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
Mục đích:
Phát hiện và định danh V. cholerae bằng phương pháp nuôi cấy kinh điển.
Xác định mức độ nhạy cảm với kháng sinh của V. cholerae.
Nguyên lý:
Vi khuẩn được định danh dựa vào đặc điểm nuôi cấy, một số tính chất chuyển hóa, các đặc điểm về hình thái học và tính chất kháng nguyên.
Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của V. cholerae được xác định bằng phương pháp kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán và được phiên giải ra phân loại S, I, R dựa trên tài liệu hướng dẫn CLSI được cập nhật hàng năm.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện:
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành vi sinh.
Phương tiện, hóa chất:
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị:
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Kính hiển vi quang học.
Dụng cụ sấy lam (nếu có).
Tủ ấm thường.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Thực hiện xét nghiệm 01 mẫu bệnh phẩm / lần.
.png)
Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần / 1 năm).
Bệnh phẩm:
Phân của người bệnh.
Phiếu xét nghiệm:
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm:
Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh (xem Phụ lục 1).
Tiến hành kỹ thuật:
Nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi quang học.
Nuôi cấy, định danh.
Nuôi cấy trên môi trường pepton kiềm, thạch kiềm và TCBS để ở điều kiện 37ºC. Sau mỗi 6 giờ cấy chuyển váng ở ống pepton kiềm sang môi trường thạch kiểm và TCBS. Khi nhìn thấy có khuẩn lạc nghi ngờ V. cholera mọc thì dừng không cấy chuyển nữa.
Bắt khuẩn lạc nghi ngờ.
Xác định tính chất sinh vật hóa học bằng kít API 20E.
Ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu.
Kháng sinh đồ.
Lựa chọn các khoanh giấy kháng sinh thử nghiệm cho V. cholerae theo hướng dẫn của CLSI để làm kháng sinh đồ bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Định danh:
Hình thái học: Vibrio cholerae có hình ảnh phẩy khuẩn, bắt màu Gram âm (màu đỏ).
Tính chất nuôi cấy: Nuôi cấy trên môi trường thạch kiềm (37ºC), khuẩn lạc dạng S, trong như giọt sương; trên môi trường TCBS, khuẩn lạc dạng S, màu vàng. Trong môi trường pepton kiềm, vi khuẩn mọc nhanh, sau 6 - 8h tạo thành váng trên mặt môi trường.
Một số tính chất sinh vật hóa học: Lên men không sinh hơi đường glucose, saccharose, maltose, mannitol. Không lên men đường lactose, arabinose. Oxydase (+), indol (+), citrate simmons (+), LDC (+), ODC (+), ONPG (+). Urease (-), VP (±), ADH (-).
Phát hiện kháng thuốc:
Đọc kháng sinh đồ và trả kết quả theo hướng dẫn của CLSI.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Sai sót:
Vibrio cholerae có thể bắt màu Gram dương do tẩy cồn chưa đủ hoặc làm đồ phiến quá dầy.
Vibrio cholerae có thể không mọc do đốt ăng quá nóng, điều kiện nuôi cấy không đảm bảo, lượng bệnh phẩm quá ít.
Xử trí:
Tuân thủ đúng các bước của quy trình nhuộm Gram.
Kiểm tra chất lượng thuốc nhuộm hàng tuần với chủng chuẩn.
Để ăng nguội trước khi tiến hành nuôi cấy.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
