MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
Mục đích:
Xác định sự có mặt gen đặc trưng của Varicella zoster virus (VZV) trong dịch não tủy, dịch vết loét hoặc mảnh sinh thiết ở người.
Nguyên lý:
Xác định gen đặc trưng của Varicella zoster virus (VZV) dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real-time PCR.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện:
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành vi sinh.
Phương tiện, hóa chất:
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị:
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Máy ủ nhiệt.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy vortex.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Tủ lạnh 2ºC - 8ºC.
Tủ âm sâu (- 20ºC hoặc -70ºC).
Micropipette các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm).
Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu / lần.
.png)
Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần / 1 năm).
Bệnh phẩm:
Dịch não tủy, dịch vết loét hoặc mảnh sinh thiết...
Phiếu xét nghiệm:
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm:
Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 3.
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.
Tiến hành kỹ thuật:
Bộ sinh phẩm Real-time PCR định tính Varicella zoster virus (VD).
Tách chiết DNA:
Có thể dùng kit tách chiết DNA bằng hoá chất phenol/chloroform hoặc tách chiết bằng cột của các nhà sản xuất khác như Qiagen, Stratec, Roche...
Thực hiện phản ứng real-time PCR:
Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
Cho chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube VZV rPCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.
Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình realtime PCR.
Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
Chọn màu “CY5” và “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.
Lưu file dữ liệu vào máy tính.
Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Điều kiện của phản ứng:
Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu CY5 dương tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc âm tính.
Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu CY5 âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính
Phân tích mẫu:
Những mẫu dương tính chỉ cần chọn màu CY5 để phân tích, không cần quan tâm đến chứng nội, chứng nội có thể dương hoặc âm.
Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.
In đồ thị kết quả.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
Nguyên nhân:
Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục:
Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết.
Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
