✴️ Nhuộm Orcein phát hiện kháng nguyên HBsAg trong mô gan

NGUYÊN TẮC

Thông thường, virus có kích thước rất nhỏ và chỉ có thể quan sát được dưới kính hiển vi điện tử. Virus chỉ được coi là vật ký sinh khi chúng sinh sản (được nhân lên) trong tế bào vật chủ. Các tiểu phần virus nằm bên trong tế bào vật chủ được gọi là “thể vùi virus” và có thể thấy bằng kính hiển vi quang học. HBsAg (kháng nguyên bề mặt của virus viêm gan B) thường xuất hiện dưới dạng thể vùi trong bào tương tế bào gan. Bào tương của tế bào Küpffer cũng có thể có kháng nguyên này.

Phẩm nhuộm orcein và andehit - fuscin có khả năng nhuộm cầu nối disunfit có trong thành phần cistin của HBsAg và tạo ra hình ảnh “thủy tinh mờ” của tế bào gan bị nhiễm virus.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện

Kỹ thuật viên giải phẫu bệnh - tế bào bệnh học: 02

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất chung

Dung dịch cố định bệnh phẩm.

Cồn (70^o, 80^o, 95^o , 100^o).

Xylen hay toluen.

Nước cất 2 lần.

Parafin.

Sáp ong.

Albumin + glycerin.

Máy đo độ pH điện tử.

Máy chuyển bệnh phẩm tự động.

Máy đúc khối parafin.

Bàn hơ dùng điện.

Máy cắt lát mỏng (microtome).

Lưỡi dao cắt lát mỏng.

Bể nhuộm bằng thủy tinh.

Bể thủy tinh đựng cồn, xylen.

Hộp bằng thép không rỉ đựng parafin.

Khuôn nhựa.

Giá đựng tiêu bản (đứng và nằm ngang).

Cốc đong loại 1000ml, 500ml, 100ml và 50ml.

Ống hút bằng nhựa, quả bóp cao su hút hóa chất.

Kẹp không mấu, kéo.

Cân phân tích.

Giấy lọc.

Phiến kính, lá kính.

Acid picric ngâm, làm sạch phiến kính. - Lò nấu parafin.

Tủ ấm 370 và 560.

Tủ lạnh.

Điều hòa nhiệt độ.

Tủ hốt phòng thí nghiệm.

Nguồn cấp nước chảy.

Bôm Canada hoặc keo gắn lá kính.

Kính hiển vi 2 mắt để kiểm tra kết quả nhuộm.

Kính phòng hộ, găng tay các loại, mặt nạ phẫu thuật, áo choàng phẫu thuật.

Phương tiện, hóa chất riêng biệt cho kỹ thuật

Phẩm nhuộm (hoặc dùng phẩm nhuộm có sẵn của các hãng): permanganat kali, acid sunfuric đậm đặc, acid oxalic, Orcein, acid periodic, HCl.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Cố định

Bệnh phẩm được lấy ra khỏi cơ thể được cố định ngay trong dung dịch formol đệm trung tính 10% với tỷ lệ thể tích dung dịch cố định nhiều gấp 20 - 30 lần thể tích bệnh phẩm. Thời gian cố định từ 2-12 giờ tuỳ theo mảnh bệnh phẩm to hay nhỏ.

Sau cố định, bệnh phẩm được thực hiện qua các khâu kỹ thuật sau:

Chuyển bệnh phẩm

Vùi parafin

Đúc khối parafin

Cắt và dán mảnh cắt

Nhuộm mảnh cắt

Chuẩn bị phẩm nhuộm

Dung dịch permanganat kali được acid hóa:

Permanganat kali: 0,3 g

Nước cất: 100ml

Acid sunfuric đậm đặc:    0,3ml 6.1.2. Dung dịch acid oxalic:  1,5%

Pha orcein:

Hòa tan 1,0g orcein tổng hợp bằng cách đổ dần dần từng ít cồn 70^o trong khi đang đun nóng nhẹ, cách thủy, vào khoảng 56ºC (tổng lượng cồn cần dùng để hòa tan là 100ml) cho đến khi hòa tan hết.

Sau đó, thêm 1 ml HCl đậm đặc.

Dung dịch acid periodic 5%

Tiến hành kỹ thuật

Tẩy parafin bằng 3 bể toluen (xylen), mỗi bể 2 phút

Chuyển vào các bể cồn 100°, 95°, 80° mỗi bể 2 phút

Rửa nước

Oxy hóa trong permanganat kali (5 - 10 phút)

Rửa nước

Tẩy trắng trong acid oxalic (nhìn cho tới trắng)

Rửa nước chảy, rồi rửa lại bằng nước cất

Acid periodic 5% trong 5 phút

Rửa nước chảy, rồi rửa lại bằng nước cất

Nhuộm orcein trong lò vi sóng ở công suất thấp trong 30 - 45 giây, rồi tiếp tục để như vậy trong 30 phút. Kiểm tra dưới kính hiển vi, có thể nhuộm lại nếu chưa đủ màu đen.

Rửa trong cồn 70^o.

Biệt hóa trong cồn-acid 1% cho tới khi không còn phẩm màu chảy ra từ mảnh cắt.

Rửa bằng cồn 70^o.

Làm mất nước nhanh bằng cồn 95º và cồn tuyệt đối

Làm trong bằng 3 bể toluen sạch

Gắn lá kính như thường lệ

KẾT QUẢ

Kháng nguyên HBsAg, sợi chun:đỏ tía

Các protein liên kết với đồng :đỏ tía sẫm

Nền: đỏ tía ánh nâu nhạt

NHỮNG SAI SÓT VÀ HƯỚNG XỬ TRÍ

Các kháng nguyên này thường tập trung thành hạt to, nhỏ khác nhau trong bào tương tế bào gan. Trường hợp hạt nhỏ, thường ở dạng lan tỏa, trong khi, dạng hạt lớn hơn, có hình tròn hoặc bầu dục lại tụ thành nhóm.

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

  facebook.com/BVNTP

  youtube.com/bvntp