Nguồn: Nicole Jawerth. How is the COVID-19 virus detected using real time RT–PCR?
International Atomic Energy Agency. June, 2020.
Biên dịch: SVD. Nguyễn Thanh Huyền – Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch
RT-PCR là gì?
RT-PCR (Reverse Transcription–Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật có nguồn gốc từ hạt nhân để phát hiện sự hiện diện của vật liệu di truyền cụ thể trong các tác nhân gây bệnh, bao gồm cả vi rút. Ban đầu, kỹ thuật này sử dụng các chất đánh dấu đồng vị phóng xạ để phát hiện các vật liệu di truyền được nhắm mục tiêu. Tuy nhiên, quá trình tinh chế sau đó đã dẫn đến việc thay thế các chất đánh dấu đồng vị phóng xạ bằng các chất đánh dấu đặc biệt khác, thường là thuốc nhuộm huỳnh quang. Kỹ thuật này cho phép các nhà khoa học nhìn thấy kết quả gần như là ngay lập tức khi quá trình phân tích vẫn đang diễn ra, trong khi PCR thông thường chỉ cung cấp kết quả vào cuối quá trình.
RT-PCR là một trong những xét nghiệm được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay để phát hiện vi rút COVID-19. Tuy nhiên, trong khi nhiều quốc gia đã sử dụng RT-PCR để chẩn đoán các bệnh khác như vi rút Ebola và vi rút Zika thì nhiều quốc gia vẫn cần được hỗ trợ trong việc điều chỉnh kỹ thuật này để chẩn đoán vi rút COVID-19 cũng như nâng cao năng lực xét nghiệm.
.png)
Vi rút là gì? Vật chất di truyền là gì?
Vi rút là một gói vật chất di truyền cực nhỏ được bao quanh bởi một lớp vỏ phân tử. Vật liệu di truyền của vi rút có thể là acid deoxyribonucleic (ADN) hoặc acid ribonucleic (ARN).
ADN là một phân tử sợi kép, chứa mã di truyền về cách mà các sinh vật hình thành và phát triển. ADN được tìm thấy trong tất cả các sinh vật như động vật, thực vật và vi rút.
ARN là một phân tử sợi đơn có chức năng sao chép, phiên mã và truyền các mã di truyền tới protein để tổng hợp và thực hiện các chức năng giữ cho sinh vật sống và phát triển. Các biến thể khác nhau của ARN chịu trách nhiệm sao chép, phiên mã và truyền dạt thông tin di truyền.
Một số loại vi rút như coronavirus SARS-CoV-2 gây ra bệnh COVID-19 chỉ chứa ARN, có nghĩa là vi rút dựa vào việc xâm nhập vào các tế bào khỏe mạnh để nhân lên và tồn tại trong tế bào. Khi vào trong tế bào, vi rút sử dụng mã di truyền của chính nó để kiểm soát và “lập trình lại” các tế bào, biến các tế bào trong cơ thể trở thành nhà máy sản xuất vi rút.
Để một loại vi rút như vi rút COVID-19 được phát hiện sớm trong cơ thể bằng cách sử dụng RT-PCR, các nhà khoa học cần chuyển ARN thành ADN. Đây là một quá trình gọi là “phiên mã ngược”. Họ phải làm được điều này vì chỉ ADN mới có thể được sao chép hoặc khuếch đại để kỹ thuật RT-PCR có thể phát hiện ra vi rút.
Các nhà khoa học khuếch đại một phần ADN vi rút cụ thể, đã được phiên mã lên hàng trăm nghìn lần. Việc khuếch đại ADN là rất quan trọng. Thay vì cố gắng phát hiện một lượng nhỏ vi rút trong số hàng triệu chuỗi thông tin di truyền, nhờ khuếch đại mà các nhà khoa học sẽ có một lượng ADN vi rút đủ lớn để xác nhận một cách chính xác rằng vi rút đang tồn tại trong cơ thể người.
RT-PCR hoạt động như thế nào với vi rút COVID-19?
Mẫu xét nghiệm được thu thập từ các bộ phận của cơ thể người, nơi vi rút COVID-19 tập trung, chẳng hạn như mũi hoặc cổ họng. Mẫu sau khi thu thập sẽ được xử lý bằng một số dung dịch hóa học để loại bỏ các chất như protein và chất béo và chỉ chiết xuất ARN có trong mẫu. ARN được chiết xuất là sự kết hợp giữa vật liệu di truyền của chính người được lấy mẫu và cả ARN của vi rút COVID-19 (nếu có).
.png)
ARN được phiên mã ngược thành ADN bằng cách sử dụng một loại enzyme. Sau đó, các nhà khoa học sẽ bổ sung thêm các đoạn ADN ngắn cho các phần đích của ADN vi rút. Nếu vi rút có trong mẫu, các đoạn này sẽ tự động gắn vào các phần đích của ADN vi rút. Một số đoạn ADN thêm vào được sử dụng để xây dựng chuỗi ADN trong quá trình khuếch đại. Một số đoạn ADN khác được sử dụng để xây dựng ADN. Các chất đánh dấu (như thuốc nhuộm huỳnh quang) sẽ được thêm vào để phát hiện sự tồn tại của vi rút.
Sau đó, hỗn hợp được đặt vào máy RT-PCR. Máy quay vòng qua nhiệt độ làm nóng và làm nguội hỗn hợp để kích hoạt các phản ứng hóa học cụ thể tạo ra các bản sao mới, giống hệt với các phần đích của ADN vi rút. Chu kỳ được lặp đi lặp lại để tiếp tục sao chép các đoạn đích của ADN vi rút. Mỗi chu kỳ tăng gấp đôi bản sao ADN vi rút, 2 bản sao trở thành 4, 4 bản sao trở thành 8, v.v... Việc thiết lập RT-PCR thường trải qua 35 chu kỳ, có nghĩa là vào cuối quá trình, khoảng 35 tỷ bản sao mới của ADN vi rút được tạo ra từ mỗi sợi vi rút có trong mẫu.
Khi các bản sao mới của ADN vi rút được tạo ra, các chất đánh dấu sẽ gắn vào các sợi ADN, sau đó giải phóng thuốc nhuộm huỳnh quang, được máy tính đo và hiển thị ngay trên màn hình. Máy tính theo dõi lượng huỳnh quang trong mẫu sau mỗi chu kỳ. Khi vượt qua một mức độ huỳnh quang nhất định, điều này xác nhận rằng vi rút đang tồn tại. Các nhà khoa học cũng theo dõi cần bao nhiêu chu kỳ để đạt được mức độ huỳnh quang này để ước tính mức độ nghiêm trọng của nhiễm vi rút COVID-19: càng ít chu kỳ, nhiễm vi rút càng nặng !
Tại sao sử dụng RT-PCR?
Kỹ thuật RT-PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể đưa ra chẩn đoán đáng tin cậy trong vòng ít nhất là 3 giờ, mặc dù thông thường các phòng thí nghiệm mất trung bình từ 6-8 giờ. So với các phương pháp phân lập vi rút hiện có khác, RT-PCR nhanh hơn đáng kể và khả năng sai sót thấp hơn vì toàn bộ quy trình được thực hiện trong một ống kín. Đây là phương pháp chính xác nhất hiện có để phát hiện vi rút COVID-19.
Tuy nhiên, RT-PCR không thể phát hiện các trường hợp đã từng nhiễm vi rút trong quá khứ. Điều này rất quan trọng để hiểu sự phát triển và lây lan của vi rút vì vi rút chỉ hiện diện trong cơ thể người trong một khoảng thời gian nhất định. Các phương pháp khác là cần thiết để phát hiện, theo dõi và nghiên cứu các bệnh nhiễm trùng trong quá khứ, đặc biệt là những bệnh có thể đã phát triển và lây lan mà không có biểu hiện triệu chứng.
PCR là gì và khác gì với RT-PCR?
RT-PCR là một phiên bản của PCR. Hai kỹ thuật sử dụng cùng một quy trình nhưng RT-PCR có thêm một bước phiên mã ngược, chuyển ARN thành ADN để cho phép khuếch đại ADN. Điều này có nghĩa là, PCR được sử dụng cho các tác nhân gây bệnh như vi rút và vi khuẩn đã chứa sẵn ADN để khuếch đại, trong khi RT-PCR được sử dụng cho các tác nhân gây bệnh chứa ARN cần được phiên mã thành ADN để khuếch đại. Cả hai kỹ thuật đều cho kết quả gần như ngay lập tức, nhưng RT-PCR hiển thị kết quả ngay khi phản ứng đang xảy ra còn PCR hiển thị kết quả sau khi phản ứng kết thúc.
PCR là một trong những xét nghiệm chẩn đoán đã được sử dụng rộng rãi để phát hiện các tác nhân gây bệnh, bao gồm cả vi rút gây ra các bệnh như Ebola, dịch tả lợn Châu Phi và bệnh lở mồm long móng. Vì vi rút COVID-19 chỉ chứa ARN nên RT-PCR được sử dụng để phát hiện vi rút COVID-19.
Trong hơn 20 năm IAEA hợp tác với FAO, họ đã đào tạo và trang bị cho các chuyên gia từ khắp nơi trên thế giới về cách sử dụng kỹ thuật RT-PCR thông qua Mạng lưới các phòng thí nghiệm chẩn đoán thú y (VETLAB). Gần đây, kỹ thuật này cũng đã được sử dụng để chẩn đoán các bệnh khác như Ebola, Zika, hội chứng hô hấp Trung Đông (Middle East respiratory syndrome - MERS) và hội chứng hô hấp cấp tính nghiêm trọng (Severe Acute Respiratory Syndrome - SARS),v.v...
RT-PCR cũng đã được sử dụng để phát hiện các bệnh lây truyền từ động vật sang người: sự thật rằng các bệnh từ động vật cũng có thể lây nhiễm sang người!
Xem thêm: Giá trị của chỉ số CT trong xét nghiệm RT-PCR Sars-CoV-2
Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh
