Vi sinh vật nhiễm khuẩn đường ruột Real- time PCR đa tác nhân

MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ

Mục đích:

Xác định DNA / RNA đặc trưng của các loại vi sinh vật trong phân của người.

Nguyên lý:

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

CHUẨN BỊ

Người thực hiện:

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành vi sinh (và / hoặc sinh học phân tử / sinh học / công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành vi sinh (và / hoặc sinh học phân tử / sinh học / công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương):

Trang thiết bị:

Máy Real-time PCR đa màu và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện.

Máy ủ nhiệt.

Máy ly tâm > 12000 gpm / phút.

Máy ly tâm lạnh.

Tủ lạnh 2^oC -8^oC.

Tủ âm sâu (-20^oC) hoặc (-70^o0C) (nếu có).

Máy vortex.

Tủ an toàn sinh học .

Micropipettes các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.

Đầu côn có phin lọc các thể tích từ 5 µl - 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm):

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị
1	Lọ đựng bệnh phẩm vô trùng	Cái
2	Tăm bông vô trùng	Cái
3	Găng không có bột tal ( DNase-RNase free)	Đôi
4	Khay đựng bệnh phẩm	Cái
5	Hộp vận chuyển bệnh phẩm	Cái
6	Sinh phẩm chẩn đoán	Test
7	Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng	Test
8	Hóa chất và vật tư tiêu hao cho tách acid nucleic	Test
9	Tube eppendorff 1,5 ml	Cái
10	Strip 8 tubes 0,1 ml	Cái
11	Nắp đậy strip 8 tubes	Cái
12	Đầu côn có phin lọc 1 ml	Cái
13	Đầu côn có phin lọc 200 µl	Cái
14	Đầu côn có phin lọc 30 µl	Cái
15	Đầu côn có phin lọc 10 µl	Cái
16	Giấy thấm không bụi	Cuộn
17	Giấy xét nghiệm	Tờ
18	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ
19	Bút viết kính	Cái
20	Bút bi	Cái
21	Mũ	Cái
22	Khẩu trang	Cái
23	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi
24	Quần áo bảo hộ	Bộ
25	Dung dịch xà phòng rửa tay	ml
26	Cồn sát trùng tay nhanh	ml
27	Dung dịch khử trùng	ml
28	Khăn lau tay	Cái
29	Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

Ghi chú:

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần / 1 năm).

Bệnh phẩm:

Phân.

Phiếu xét nghiệm:

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm:

Theo đúng quy định của chuyên ngành vi sinh.

Tiến hành kỹ thuật:

Thu nhận và xử lí mẫu:

Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA / RNA (nếu cần).

Tách chiết DNA / RNA.

Thực hiện phản ứng Real-time PCR.

NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ

Điều kiện của phản ứng:

Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang cho chứng nội dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính).

Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang chứng nội dương tính.

Phân tích mẫu:

Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng tương ứng với màu của từng tác nhân và bắt đầu từ chu kỳ 40 trở về trước. Một mẫu có thể dương tính với 1 hoặc nhiều tác nhân.

Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và lớn hơn chu kỳ 40 → thực hiện lại xét nghiệm. Nếu kết quả vẫn lặp lại thì trả lời kết quả dương tính. Nếu kết quả khác với lần đầu thì yêu cầu lấy lại mẫu bệnh phẩm khác để kiểm tra lại.

Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.

NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ

Sự cố:

Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

Nguyên nhân:

Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.

Khắc phục:

Pha loãng mẫu từ 10 - 100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu.

Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

facebook.com/BVNTP