✴️ Kỹ thuật miễn dịch sử dụng trong chẩn đoán vi sinh vật (P1)

BẢN CHẤT CỦA SỰ KẾT HỢP GIỮA KHÁNG NGUYÊN VÀ KHÁNG THỂ

Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt của kháng nguyên và kháng thể. Sự kết hợp này xảy ra giữa một phần rất giới hạn giữa phân tử kháng nguyên (nhóm quyết định) và một phần rất giới hạn của phân tử kháng thể (trung tâm hoạt động).

Theo Pauling, phân tử kháng thể thường hóa trị hai nghĩa là cùng một lúc có thể kết hợp với hai phân tử kháng nguyên. Còn kháng nguyên đa hóa trị nên cùng một lúc có thể kết hợp với nhiều phân tử kháng thể. Cho nên kháng nguyên và kháng thể kết hợp với nhau để tạo thành một phức hợp hình mạng lưới trong không gian ba chiều. Vì kích thước quá lớn nên phức hợp kết tủa hoặc ngưng kết.

Kháng nguyên và kháng thể có thể kết hợp với nhau theo bất cứ tỷ lệ nào nhưng phản ứng yếu đi nếu thừa hoặc thiếu kháng nguyên hoặc kháng thể. Phản ứng rõ rệt nhất lúc số phân tử kháng nguyên tương đương với số phân tử kháng thể.

Sự kết hợp giữa phân tử kháng nguyên và kháng thể xảy ra nhờ các lực như: lực liên kết ion (lực tĩnh điện Coulomb) giữa các nguyên tử hoặc các nhóm hoá học mang điện trái dấu, ví dụ giữa NH3+ và COO-, lực liên kết của các cầu nối hydro giữa các nguyên tử hydro mang điện tích dương với các nguyên tử mang điện tích âm, lực Van der Walls (lực hấp dẫn liên phân tử) giữa hai phân tử phụ thuộc vào tương tác giữa các lớp mây điện tử ở mặt ngoài và lực ố thuỷ nếu ở diện tiếp xúc cả phía kháng nguyên và kháng thể đều có các axít amin ố thuỷ thì khi kháng nguyên kháng thể kết hợp, nước sẽ bị đẩy ra tạo nên một lực gắn giữa các axít amin ố thuỷ đó, sự kết hợp này không phải là một phản ứng hóa học.

Phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể rất đặc hiệu. Một kháng nguyên chỉ kết hợp với kháng thể do nó kích thích cơ thể tạo thành. Do đó phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể được sử dụng để xác định kháng nguyên hoặc kháng thể nếu một trong hai phân tử đã biết.

Hiệu giá của kháng thể ở trong huyết thanh người hoặc động vật có thể xác định nhờ kháng nguyên đã biết và do đó cho biết sự tiếp xúc trước đó với kháng nguyên. Ngược lại nhờ kháng thể đã biết những kháng nguyên khác nhau của một vi sinh vật có thể nhận mặt. Mặt khác sự hiểu biết cấu tạo kháng nguyên cho phép chọn lựa thích đáng vi sinh vật dùng làm vaccine phòng ngừa bệnh nhiễm trùng.

PHẢN ỨNG KẾT TỦA

Nguyên lý:

Phản ứng kết tủa là sự kết hợp giữa kháng nguyên hòa tan lúc gặp kháng thể tương ứng, tạo thành tủa có thể quan sát trực tiếp bằng mắt thường hoặc nhờ soi kính lúp.

Kháng nguyên đa hóa trị kết hợp với kháng thể hóa trị hai để tạo thành kết tủa hình mạng lưới 3 chiều. Phản ứng có thể thực hiện ở môi trường lỏng hoặc môi trường gel.

Phản ứng kết tủa ở môi trường lỏng:

Phản ứng định tính:

Được thực hiện với kháng huyết thanh pha loãng hoặc không pha loãng. Kháng huyết thanh và kháng nguyên được trộn với nhau và quan sát kết tủa tạo thành. Cũng có thể cho kháng huyết thanh vào một ống nghiệm nhỏ rồi sau đó cho kháng nguyên dần dần vào theo thành ống. Một vòng kết tủa được quan sát ở mặt phẳng phân cách.

Phản ứng định lượng:

Cho phép xác định lượng kháng thể kết tủa với một lượng kháng nguyên đã biết. Cho một lượng kháng nguyên tăng dần vào một lượng kháng huyết thanh không đổi,lấy kết tủa bằng ly tâm và định lượng protein bằng những phương pháp thông thường để xác định lượng kháng thể đã phản ứng.

Phản ứng kết tủa ở môi trường gel:

Phản ứng khuếch tán đôi Ouchterlony:

Kháng nguyên và kháng thể được đặt vào những lỗ đục ở trong thạch. Chúng khuếch tán và tạo nên những đường kết tủa ở trên mặt thạch. Một phẩm vật chứa nhiều kháng nguyên tạo thành nhiều đường kết tủa.

Những liên hệ miễn dịch giữa hai kháng nguyên có thể khảo sát bằng phản ứng khuếch tán đôi. Những dải kết tủa tạo thành có thể cho biết sự tương đồng miễn dịch, sự đồng nhất từng phần hoặc sự không liên hệ.

Phản ứng khuếch tán đơn:

Có thể làm cho sự khuếch tán ở môi trường gel nhạy hơn bằng cách trộn kháng thể vào thạch. Kháng nguyên được cho khuếch tán từ một lỗ đục ở trên môi trường thạch chứa kháng thể. Lúc bắt đầu khuếch tán, kháng nguyên còn ở nồng độ cao nên tạo thành những phức hợp hòa tan. Lúc khuếch tán xa hơn, nồng độ hạ dần cho đến khi đạt một trị số thích nghi ở đó vòng kết tủa được tạo thành. Phương pháp này không những có thể  ứng dụng để nhận mặt kháng nguyên mà còn có thể cho phép định lượng IgG ở trong huyết thanh.

PHẢN ỨNG NGƯNG KẾT

Nguyên lý:

Phản ứng ngưng kết là sự kết hợp giữa kháng nguyên hữu hình với kháng thể tương ứng, tạo thành các hạt ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường.

Kháng nguyên có thể là vi khuẩn, hồng cầu, bạch cầu, tinh trùng... Phản ứng ngưng kết chi xảy ra nếu có chất điện giải, rõ nhất, nhanh nhất ở pH từ 7 đến 7,2 và ở nhiệt độ 37^oC.

Phản ứng ngưng kết trực tiếp:

Vi sinh vật sống và chết đều có khả năng ngưng kết với kháng thể. Với vi sinh vật sống, thực hiện phản ứng trên một phiến kính. Phản ứng này thường được sử dụng để nhận mặt vi khuẩn. Ngoài vi khuẩn, các tế bào như hồng cầu, tinh trùng... đều có khả năng ngưng kết với kháng thể đối ứng.

Trường hợp kháng nguyên là vi sinh vật chết, thực hiện phản ứng trong ống nghiệm để xác định hiệu giá kháng thể ở trong huyết thanh trong chẩn đoán bệnh như phản ứng Widal trong chẩn đoán bệnh thương hàn.

Phản ứng ngưng kết gián tiếp:

Ở đây kháng nguyên và kháng thể chỉ ngưng kết khi có sự hiện diện của một nhân tố thứ 3. Phản ứng Coombs là một ví dụ. Người mẹ Rh- sinh đúa con Rh+ (kháng nguyên D). Lúc sinh con, hồng cầu Rh+ lọt vào máu người  mẹ và khích động sự tạo thành kháng thể D. Kháng thể D có thể lọt qua nhau trong những lần mang thai sau. Phản ứng giữa kháng thể D và kháng nguyên D có thể phá hủy hồng cầu và gây nên chứng tan máu ở trẻ sơ sinh.

Để phòng ngừa cho bà mẹ Rh- khỏi bị nhạy cảm hóa bởi kháng nguyên D của đứa con Rh+, tiêm vào người mẹ ngay trước khi sinh đứa con thứ nhất một lượng nhỏ kháng thể D.

Phản ứng ngưng kết thụ động:

Kháng nguyên hòa tan được hấp phụ lên bề mặt những nền mượn như hạt bentonit, hạt latex nhưng thông dụng nhất là hồng cầu cừu. Những hạt này ngưng kết với kháng thể nhờ sự hiện diện của kháng nguyên dính vào bề mặt chúng. Những hạt này khá lớn nên phản ứng dương tính có thể khám phá bằng mắt thường. Trong trường hợp hồng cầu được sử dụng làm giá mang kháng nguyên thì phản ứng được gọi là phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động.

Để phát hiện kháng nguyên, người ta gắn kháng thể lên nền mượn. Khi kháng thể gặp kháng nguyên đặc hiệu, hiện tượng ngưng kết sẽ xuất hiện. Loại này được gọi là phản ứng ngưng kết thụ động ngược.

Phản ứng ngưng kết thụ động nhạy hơn phản ứng ngưng kết trực tiếp nhờ hình thể tương đối lớn của những hạt mang kháng nguyên và độ đặc hiệu cao hơn phản ứng ngưng kết trực tiếp vì có thể tinh chế được các kháng nguyên hoặc kháng thể trước khi gắn lên nền mượn. Loại phản ứng này được dùng trong chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm trùng như dịch hạch, Whitmore, viêm màng não mủ...

Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu:

Có một số virus có khả năng ngưng kết hồng cầu của một số động vật và phản ứng đó bị ức chế bởi kháng huyết thanh của virus. Đó là phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu. Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu được sử dụng để chẩn đoán nhiều chứng bệnh virus như cúm, quai bị, sốt xuất huyết, đậu mùa...

PHẢN ỨNG KẾT HỢP BỔ THỂ

Nguyên lý:

Kháng thể đặc hiệu với sự tham gia của bổ thể sẽ gây ly giải tế bào vi khuẩn hoặc một số tế bào động vật khác.

Các giai đoạn tiến hành phản ứng kết hợp bổ thể:

Trong phòng thí nghiệm người ta thực hiện phản ứng kết hợp bổ thể bằng cách ghép 2 hệ thống phản ứng:

Trong hệ thống 1, kháng nguyên được cho tác dụng với kháng thể (một yếu tố biết, một yếu tố chưa biết). Nếu kháng nguyên và kháng thể phản ứng đặc hiệu thì tất cả lượng bổ thể kết hợp vào phức hợp kháng nguyên - kháng thể.

Hệ thống thứ hai được sử dụng để nhận mặt bổ thể tự do (không kết hợp). Thêm vào hệ thống thứ nhất những hồng cầu cừu và huyết thanh kháng hồng cầu cừu (hệ thống tan máu). Lúc bổ thể kết hợp vào phức hợp KN-KT của hệ thống 1 thì không còn bổ thể để ly giải hồng cầu cừu đã nhạy cảm hóa. Nếu ở hệ thống 1, kháng nguyên và kháng thể không phản ứng đặc hiệu với nhau thì bổ thể tự do kết hợp với phức hợp hồng cầu cừu - kháng hồng cầu cừu và do đó  làm tan hồng cầu cừu. Cho nên đọc kết quả phản ứng dương tính lúc không có tan máu và âm tính lúc có tan máu.

Phản ứng kết hợp bổ thể được sử dụng để chẩn đoán bệnh giang mai, bệnh virus cũng như để nhận mặt kháng nguyên và kháng thể.

Xem tiếp: Kỹ thuật miễn dịch sử dụng trong chẩn đoán vi sinh vật (P2)

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

  facebook.com/BVNTP

  youtube.com/bvntp