✴️ Các xét nghiệm đông máu: Xét nghiệm yếu tố Willebrand (P3)

PHẦN 6: XÉT NGHIỆM PRE-PROPEPTIDE (VWFPP)

Trong lịch sử, VWFpp được biết như là VWF:AgII

Trong type 1, đột biến làm giảm khả năng cắt của ADAMTS13, dẫn đến hiện diện các multimer kích thước siêu lớn => tăng đào thải, làm giảm VWF.

Đo VWFpp có giá trị trong việc phân biệt liệu VWF giảm là do giảm tổng hợp hay tăng đào thải. Trong giảm tổng hợp thì tỉ số giữa VWFpp và VWF:Ag bằng 1, trong khi tăng thải thì tỉ số này tăng lên.

Các chế phẩm VWF cô đặc không có bất cứ VWFpp nào.

Type 1 Vicenza và những biến thể tương tự với thời gian bán hủy VWF ngắn, được xếp vào nhóm 1C.

GIỚI THIỆU

VWF được tổng hợp là protein gồm 2813 amino acid với 22 amino acid làm peptide tín hiệu, 741 amino acid làm pre-propeptide và một protein trưởng thành 2050 amino acid (pro-VWF). Chúng trải qua quá trình dimer hóa trong lưới nội bào tương thông qua cầu nối disulphide ở đầu C tận. Những dimer này sau đó được chuyển đến bộ máy Golgi, tại đây nó được tạo các liên kết chéo qua thành viên cysteine ở đầu N tận, tạo thành hàng loạt những multimer, làm tăng trọng lượng phân tử. Cũng tại bộ máy Golgi, phần pre-propeptide được tách ra khỏi mảnh protein trưởng thành.

VWFpp có nồng độ trong huyết tương khoảng 1µg/ml và thời gian bán hủy 2-3 giờ, trong khi đó mảnh VWF trưởng thành có nồng độ 10 µg/ml và thời gian bán hủy 8-12 giờ.

Một cơ chế mới trong Type 1 VWD liên quan đến việc tăng đào thải VWD khỏi huyết tương. Những bệnh nhân này cho thấy triệu chứng chảy máu cổ điển của type 1, xét nghiệm giảm VWF:Ag, VWF:RCo, FVIII và di truyền mô hình kiểu trội. Multimer cho thấy sự hiện diện của nhứng siêu phân tử. Sử dụng DDAVP cho thấy tăng đáng kể cả mức

VWF và FVIII nhưng chúng nhanh chóng bị đào thải khỏi huyết tương, ngược với type 1 cổ điển, tốc độ đào thải chậm hơn nhiều.

NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP

Sử dụng ELISA với kháng thể và kháng kháng thể đặc hiệu của VWFpp

PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

Ở những bệnh nhân type 1 do tăng đào thải, tỉ số VWFpp/VWF:Ag có xu hướng tăng (khoảng bằng 4). Điều này gợi ý VWFpp có thời gian bán hủy bình thường nhưng của VWF trưởng thành thì giảm, nó bị đào thải nhanh chóng do đột biến bên trong protein VWF trưởng thành.

Type 1C có chức năng VWF-tiểu cầu bình thường, mức VWF huyết tương 6-10IU/dl và sự hiện diện của những multimer kích thước siêu lớn.

KHOẢNG THAM CHIẾU

VWFpp có sự khác biệt đáng kể giữa nhóm máu O và các nhóm còn lại. Gía trị tham khảo từ 55-219IU/dl, tỉ số VWFpp/VWF:Ag có kỳ vọng bằng 1.

ĐỀ NGHỊ XÉT NGHIỆM NÀO TIẾP?

Những cá nhân bất thường tỷ số VWFpp/VWF:Ag hướng đến bệnh VWD type 1 do tăng đào thải. Sử dụng DDAVP cũng giúp ích chẩn đoán.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Haberichter SL, Balistreri M, Christopherson P, Morateck P, Gavazova S, Bellissimo DB, et al. Assay of the von Willebrand factor (VWF) propeptide to identify patients with type 1 von Willebrand disease with decreased VWF survival. Blood. 2006 Nov 15;108(10):3344-51.

Nossent AY, V VANM, NH VANT, Rosendaal FR, Bertina RM, JA VANM, et al. von Willebrand factor and its propeptide: the influence of secretion and clearance on protein levels and the risk of venous thrombosis. J Thromb Haemost. 2006 Dec;4(12):2556-62.

Sztukowska M, Gallinaro L, Cattini MG, Pontara E, Sartorello F, Daidone V, et al. Von Willebrand factor propeptide makes it easy to identify the shorter Von Willebrand factor survival in patients with type 1 and type Vicenza von Willebrand disease. Br J Haematol. 2008 Sep;143(1):107-14.

Gadisseur A, Berneman Z, Schroyens W, Michiels JJ. Laboratory diagnosis of von Willebrand disease type 1/2E (2A subtype IIE), type 1 Vicenza and mild type 1 caused by mutations in the D3, D4, B1-B3 and C1-C2 domains of the von Willebrand factor gene. Role of von Willebrand factor multimers and the von Willebrand factor propeptide/antigen ratio. Acta Haematol. 2009;121(2-3):128-38.

PHẦN 7: XÉT NGHIỆM KHẢ NĂNG GẮN FVIII

VWD Type 2N giống haemophilia A hoặc người mang gene. Ở type 2N, FVIII giảm do giảm khả năng gắn của VWF với FVIII.

Trong hầu hết type 2N, đột biến tìm thấy ở exon 18-20 của gene VWF, mã hóa vị trí gắn FVIII, mặc dù đột biến ở các vùng khác gần đây cũng được báo cáo.

2 đột biến cùng xuất hiện mới đủ khả năng tạo ra kiểu hình ở bệnh nhân VWD type 2N. Rối loạn này gặp ở người đồng hợp tử hoặc dị hợp kép. Với những người đồng hợp tử, bố mẹ của họ thường là người mang gene. 

Nhớ rằng trong type 2N, FVIII giảm là do khả năng gắn của VWF với FVIII bất thường, còn các chức năng khác vẫn bình thường, nên xét nghiệm miễn dịch cũng như chức năng của nó đều bình thường.

GIỚI THIỆU

VWD type 2N là bệnh lý di truyền lặn do đột biến vị trí gắn kết của VWF với FVIII, dẫn đến giảm khả năng gắn và vận chuyển FVIII trong huyết tương. Hậu quả là thời gian bán hủy của FVIII giảm đáng kể vì nó không còn được bảo vệ trước sự thoái giáng bởi các protease trong huyết tương. Bệnh nhân VWD type 2N thỉnh thoảng bị chẩn đoán nhầm với Haemophilia A.

Chẩn đoán type 2N cần có:

• Phân tích phả hệ (bệnh di truyền lặn)
• Đo đồng thời hoạt tính FVIII và VWF (FVIII giảm nhưng hoạt tính VWF bình thường)
• Nghiên cứu khả năng gắn FVIII
• Phân tích gene

NGUYÊN LÝ VÀ PHƯƠNG PHÁP

Có một số phương pháp hiện có để đo khả năng gắn FVIII với VWF. Phương pháp ELISA thường được sử dụng:

• Một dĩa có 96 ô chuẩn được phủ bởi kháng thể kháng VWF người.
• Dĩa được ủ với mẫu huyết tương (cho phép kháng thể kháng VWF gắn kết phức hợp VWF-FVIII cố định lên dĩa)
• Dĩa được rửa, sau đó ủ với calcium chloride để loại bỏ FVIII đã gắn với VWF nội sinh trước đó (điều này để đảm bảo chỉ có VWF gắn trên dĩa)
• Nồng độ chuẩn FVIII tái tổ hợp được thêm vào để gắn với VWF đã cố định ở tất cả mẫu.
• Sau khi rửa lại, tiếp tục cho vào dĩa hoặc anti-VWF thỏ gắn peroxidase hoặc antihuman FVIII gắn peroxidase. Sau bước rửa cuối cùng, cơ chất tetramethylbenzidine dihydrochloride được thêm vào và sự tạo màu được ghi nhận như xét nghiệm VWF:Ag chuẩn.
• Đường cong chuẩn được tạo ra bằng cách sử dụng hàng loạt huyết tương bình thường pool (thường >60 người)
• Tại mỗi độ pha loãng, giá trị của yếu tố VIII tái tổ hợp được biểu diễn cùng với VWF được cố định. Giá trị VWF:FVIII được biểu diễn bằng phần trăm so với huyết tương bình thường.

PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

Những người với VWF bình thường sẽ cho thấy khả năng gắn FVIII bình thường ở bước 4, trong khi đó bệnh nhân type 2N sẽ cho thấy có rào cản trong việc gắn kết

ĐỀ NGHỊ XÉT NGHIỆM NÀO TIẾP?

Hầu hết bệnh nhân type 2N bị chẩn đoán nhầm với haemophilia A thể nhẹ. Bất kỳ bệnh nhân haemophilia A thể nhẹ nào cũng cần sàng lọc bệnh VWD type 2N. Một tình huống suy giảm kết hợp FV và FVIII cũng nên được xem xét ở bệnh nhân haemophilia A thể nhẹ.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Gaucher C, Jorieux S, Mercier B, Oufkir D, Mazurier C. The "Normandy" variant of von Willebrand disease: characterization of a point mutation in the von Willebrand factor gene. Blood. 1991;77(9):1937-41.

Tuley EA, Gaucher C, Jorieux S, Worrall NK, Sadler JE, Mazurier C. Expression of von Willebrand factor "Normandy": an autosomal mutation that mimics hemophilia A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991;88(14):6377-81.

Caron C, Mazurier C, Goudemand J. Large experience with a factor VIII binding assay of plasma von Willebrand factor using commercial reagents. Br J Haematol. 2002 Jun;117(3):716-8.

Miller CH, Kelley L, Green D. Diagnosis of von Willebrand disease type 2N: a simplified method for measurement of factor VIII binding to von Willebrand factor. Am J Hematol. 1998 Aug;58(4):311-8.

Bệnh viện Nguyễn Tri Phương - Đa khoa Hạng I Thành phố Hồ Chí Minh

  facebook.com/BVNTP

  youtube.com/bvntp